Основы хромосом человека
В 1956 году Тджио и Леван правильно определили, что число хромосом в клетках человека равно 46, и только после этого началось научное и систематическое изучение хромосом человека, что привело к формированию цитогенетики человека. В 1959 году Лежун обнаружил, что врожденная дисгенезия обусловлена трисомией 21, за которой последовали синдром Тернера и синдром Клайнфельтера, и сформировалась новая субдисциплина — клиническая цитогенетика. -С 1970-х годов развитие методов множественного хромосомного диапазона повысило точность хромосомного анализа. В середине 1980-х годов новые методы, такие как флуоресцентная гибридизация in situ, микродиссекция и окрашивание хромосом, позволили непосредственно обнаружить изменения в хромосомах и фрагментах ДНК в ядре на стадии опроса, связав исследования на клеточном уровне с исследованиями на молекулярном уровне и объединившись в новую область -молекулярная цитогенетика.
Раздел I. Хромосомы человека
I. Характеристика и типы хромосом человека
Морфологические и структурные особенности хромосом наиболее характерны для середины деления клетки во время клеточного цикла и известны как промежуточные хромосомы. Каждая промежуточная хромосома состоит из двух хромосом, каждая из которых сплетена молекулой ДНК, и эти две хромосомы называются сестринскими хроматидами. Две хромосомы соединены друг с другом хромосомой, которая является деконволютной, слегка окрашенной и внутренне суженной, называемой первичной констрикцией. Особой структурой в митотической области является место прикрепления веретена, которое связано с движением хромосом во время деления клетки. Митофаг делит хромосому по горизонтали на два плеча, более длинное из которых называется длинным плечом (q), а более короткое — коротким (p). Каждый рукав заканчивается специализированной частью, называемой теломерой, высокоповторяющейся последовательностью ДНК, которая необходима для стабильности хромосомы. Для стабильности каждой хромосомы необходимы митриола и две теломеры. Если теломера отсутствует, концы хромосом теряют свою стабильность и хромосомы соединяются аномально, что приводит к образованию аберрантных хромосом; если отсутствует митриола, хромосома не может соединиться с нитью веретена во время деления клетки, что приводит к потере хромосомы. В некоторых хромосомных рукавах можно также увидеть слегка окрашенные внутренние суженные сегменты, называемые параконстрикциями. У человека короткое плечо проксимальной хромосомы имеет нитевидную структуру на дистальной стороне хромосомы, называемую последователем, и нитевидную структуру между последователем и коротким плечом, называемую ножкой последователя, которая фактически также является зоной параконстрикции, где присутствует ген рибосомальной РНК (рРНК). Его продукт экспрессии связан с формированием нуклеолы и поддержанием ее структуры и морфологии и известен также как организатор нуклеолы (NOR). Как правило, существует два типа последователей: если диаметр последователя меньше 1/2 диаметра плеча хромосомы, он называется малым последователем, а те, которые больше 1/2 диаметра, называются большими последователями. В популяциях существует полиморфизм в длине параконтрацептов, размере и количестве последователей, который наследуется менделевским образом.
Положение митозов на хромосомах постоянно. Хромосома человека разделена на восемь равных частей вдоль продольной оси, и в зависимости от положения трофобласта хромосомы человека можно разделить на три категории: (i) субмедиальные хромосомы трофобласта, где трофобласт расположен в центре хромосомы (от 1/2 до 5/8), а длинные и короткие плечи хромосомы одинаковы; (ii) субмедиальные хромосомы трофобласта, где трофобласт расположен немного ближе к одному концу (от 5/8 до 7/8) и делит хромосому на два четко различающихся плеча; (iii) проксимальные хромосомы трофобласта (iii) проксимальные митотические хромосомы, с митотическими гранулами около одного конца (от 7/8 до конца) (рис. 6-1 и 6-2).
II. Нормальный кариотип человека
(i) Система Денвера С 1956 года, когда Тжио и Левен подтвердили, что нормальное число хромосом в соматических клетках человека равно 46, и с 1959 года, когда впервые было обнаружено, что врожденная тупость (синдром Дауна) обусловлена наличием дополнительной хромосомы 21 по сравнению с нормой, исследования хромосом человека постепенно применяются в клинической практике во всем мире, и число обнаруженных и зарегистрированных хромосомных нарушений продолжает расти. Чтобы облегчить описание аберрантных хромосом в случаях и способствовать международной коммуникации, в 1960 году в Денвере, США, была проведена Первая международная цитогенетическая конференция, на которой обсуждалась и была определена Денверская система описания внутриклеточного состава хромосом как основа для идентификации и анализа хромосом человека. Денверская система является основой для идентификации и анализа хромосом человека. Согласно системе Денвера, 46 хромосом клетки человеческого тела разделены на 23 пары, из которых пары с 1 по 22 являются общими для обоих полов, называются аутосомами и имеют порядковый номер с 1 по 22; другая пара связана с полом и называется половыми хромосомами. Две половые хромосомы — это XX хромосомы у женщин и X хромосомы и Y хромосомы у мужчин.
Изображение всех хромосом в клетке организма называется кариотипом. Процесс выявления и определения кариотипа путем сопряжения и расположения всех хромосом исследуемой клетки в соответствии с системой Денвера называется анализом кариотипа.
(ii) Определение кариотипов недоминантных хромосом Согласно системе Денвера, 23 пары хромосом в соматической клетке делятся на семь групп (от A до G) в соответствии с их размером и морфологическими характеристиками. Группировки хромосом и морфологические характеристики каждой группы показаны в таблице (6-1).
Анализ кариотипа обычно представляет собой процесс, в котором фотографии хромосом, полученные с помощью микрофотографии, идентифицируются, анализируются и вырезаются и склеиваются в соответствии с требованиями группировки. Согласно международной системе, описание нормального кариотипа включает общее число хромосом и состав половых хромосом и записывается следующим образом
Нормальный мужской кариотип 46, XY
Нормальный женский кариотип 46, XX
(iii) Визуализация хромосом и присвоение им названий
В 1968 году шведский цитохимик Касперссон обработал обычные отснятые образцы хромосом флуоресцентным красителем хинакрином (QM). После обработки образцов флуоресцентным красителем хинакрином (QM) под флуоресцентным микроскопом было обнаружено, что каждая хромосома имеет полосу различной ширины и оттенков вдоль своей длинной оси, и что каждая из 24 хромосом человека имеет характерный рисунок полосы, так что каждая хромосома может быть точно идентифицирована и охарактеризована, и даже незначительные хромосомные структурные аномалии могут быть обнаружены. Это привело к созданию метода Q-бэндинга хромосом, в котором отображаемый рисунок полос известен как Q-бэндинг. Причина, по которой хромосомы показывают полосатость, как полагают, заключается в различном составе оснований и степени запутанности спиралей молекул ДНК, составляющих хромосомы на разных участках. С момента создания метода Q-диапазона появился ряд других диапазонов, таких как G-диапазон, R-диапазон, C-диапазон и T-диапазон.
C-banding и T-banding.
Часто используемые техники бэндинга.
Образцы хромосом с Q-полосами обрабатываются флуоресцентными красителями, такими как хинакрин (QM), чтобы выявить полосы. Q-полосы характерны и стабильны, но продолжительность флуоресценции невелика, поэтому образцы нельзя хранить долгое время и их необходимо наблюдать немедленно.
G-полосы — наиболее широко используемый в настоящее время тип полос. Он прост в эксплуатации, рисунок полосы четкий, образец может сохраняться в течение длительного времени, воспроизводимость хорошая. Метод заключается в следующем: хромосому обрабатывают такими реагентами, как трипсин, NaOH, цитрат или мочевина, а затем окрашивают красителем Гимза, в результате чего проявляются чередующиеся темные и светлые полосы, что называется G-бэндингом. Наиболее часто используется метод обработки трипсином. Рисунок полос, показанный для каждого номера хромосомы, в основном похож на рисунок полос Q-полос. Более темная из G-полос соответствует более светлой из Q-полос, а более светлые полосы соответствуют более темным полосам.
Образцы хромосом R-полос обрабатываются горячим фосфатным буфером, а затем окрашиваются по Гимзе, чтобы выявить чередование темных и светлых полос. Ее также называют анти-полосой, так как она в точности противоположна по оттенку G-полосе. Концы обоих плеч хромосом с G- и Q-полосами имеют светлые полосы, поэтому трудно обнаружить структурные аномалии, такие как терминальные делеции или перестройки, тогда как концы хромосом с R-полосами имеют темные полосы, поэтому легко выявить аномалии в этой области, поэтому R-полосы в основном используются для изучения терминальных делеций и структурных перестроек хромосом.
Образцы хромосом с С-полосами обрабатываются щелочными растворами, такими как NaOH или Ba(OH)2, затем помещаются в растворы цитрата натрия и хлорида натрия, а затем окрашиваются красителем Гимза, который показывает специфическую окраску митотической области каждой хромосомы, отсюда и название митотическая полоса, также известная как С-полоса.
Строго говоря, С-полоса показывает структурно гетерохроматиновую область, непосредственно прилегающую к хромосоме, т.е. параконстрикцию хромосом 1, 9 и 16 человека вблизи хромосомы. Длинное плечо Y-хромосомы, с другой стороны, заканчивается гетерохроматиновой областью и также показывает значительное глубокое окрашивание. Поэтому для изучения структурных изменений митотической области, Y-хромосомы и параконтрацептивной области был использован метод С-бэндинга.
N-бэндинг Обработка образцов хромосом AgNO3 приводит к глубокому окрашиванию параконтрактильной области, или области нуклеолярного организатора (NOR), пяти проксимальных пар митотических хромосом (хромосомы 13, 14, 15, 2l и 22) в клетках человека, что называется N-бэндингом. Строго говоря, AgNO3 может окрашивать в черный цвет только транскрипционно активные NOR, и такие окрашенные серебром положительные NOR называются Ag-NOR. Неактивные NOR не окрашиваются. Поэтому метод N-бэндинга может быть использован для изучения активности рРНК и ее динамики, а также для наблюдения за тем, происходит ли ассоциация последователей проксимальных митотических хромосом, поскольку это является одной из причин нерасхождения хромосом.
Т-бэндинг — это процесс нагревания образцов хромосом и последующего окрашивания их красителем Gimsa, который может вызвать специфическое глубокое окрашивание некоторых концевых сегментов хромосом, называемое Т-бэндингом или телобэндингом, что может специфически показать теломеры хромосом, и эта техника может быть использована для выявления мелких концевых аберраций хромосом.
Описанные выше методы Q, G и R бэндинга обеспечивают постоянное отображение специфического рисунка бэндинга 24 хромосом человека, что указывает на объективное существование и подлинность рисунка бэндинга и обеспечивает аналитическую основу для идентификации хромосомных изменений.
Применение технологии бэндинга требует единого стандарта идентификации и описания хромосом для облегчения взаимного общения. На основании рекомендаций Четвертой международной конференции по цитогенетике человека, состоявшейся в Париже в 1971 году, и решений, принятых на встрече в Эдинбурге в 1972 году, была предложена стандартная система различения каждого хромосомного региона и полосы, названная Международной системой цитогенетической номенклатуры человека (ISCN, 1971).
1и метка: морфологически выраженная и стабильная структурная область на хромосоме, которая является важным показателем для идентификации хромосом в доминантной полосе. Она включает концы двух плеч хромосомы, рукавицу и определенные полосы, которые являются постоянными при различных условиях бэндинга.
Регион: область между двумя пограничными маркерами.
Полоса: каждую хромосому следует рассматривать как состоящую из ряда полос, т.е. не существует областей без полос. Каждая полоса может быть отличима от соседних полос по различиям в интенсивности ее более яркой (темной) или более темной (светлой) окраски.
Каждая хромосома делится на короткое и длинное плечо, используя хромосому в качестве пограничного маркера. Полосы как на коротком, так и на длинном плече нумеруются, начиная от митогена, и нумеруются в направлении от ближнего к дальнему митогену. Две зоны, расположенные ближе всего к филоподиям, нумеруются «l» для длинного или «l» для короткого плеча, а также «2» и «3» для ближней и дистальной стороны. Нумерация полос в каждой зоне следует тому же принципу, т.е. полоса, ближайшая к филаменту в данной зоне, нумеруется как полоса 1 этой зоны, затем следуют полосы 2 и 3. В двух случаях следует отметить, что полоса, которая является маркером границы, считается полосой 1 в зоне, удаленной от этого маркера; полоса, разделенная на две части филоподиями, является полосой, принадлежащей длинному и короткому рукавам.
Полоса, разделенная на две части прикрепительной гранулой, — это две полосы, принадлежащие длинному и короткому рукавам, которые записываются как полоса 1 зоны 1 длинного рукава и полоса 1 зоны 1 короткого рукава, соответственно.
Чтобы описать конкретную полосу, запишите четыре элемента: (i) номер хромосомы; (ii) символ плеча; (iii) номер зоны; и (iv) номер полосы. Они пишутся по порядку, без интервалов и знаков препинания. Например, стрелка на рисунке 6-4 показывает хромосому 1, короткое плечо, зона 3, полоса 1, записанная как lp31.
Применение метода хромосомных полос позволяет выявить широкий спектр хромосомных микроструктурных аномалий, таких как разрывы, транслокации и инверсии хромосом, и для того, чтобы иметь единый формат для описания этих изменений, Международная система цитогенетической номенклатуры человека (1978, 1981, 1985), согласованная на международной встрече в Стокгольме в 1997 году, предложила номенклатуру и сокращения для хромосом в полосах (Таблица 6-2) для единообразного применения.
3. Хромосомные полосы высокого разрешения и номенклатурные приложения Обычные полосы G используются для анализа хромосом в середине деления клетки, когда спиральность хромосом максимальна и, следовательно, хромосомы сокращаются до самых коротких, полосы имеют тенденцию к слиянию, и число показанных полос невелико. Обычно гаплохромосомы, находящиеся в средней фазе, показывают только 320 полос. С 1975 года Юнис и др. разработали метод определения полос высокого разрешения, при котором клетки синхронизируются с помощью метотрексата, а затем обрабатываются колхицином в течение короткого времени, чтобы получить много хромосом на стадиях профазы и поздней профазы. Затем следует короткая обработка колхицином для получения множества хромосом в профазной и поздней средней стадиях, а затем полосовое сканирование для выявления 550-850 полос для гаплохромосом ранней и средней стадий и 850-1250 полос для поздних стадий. Все эти полосы обусловлены относительно низкой спиральностью вытянутых хромосом, и слияние полос в 320 полосах выявляется, что значительно повышает уровень изучения хромосом. То, что раньше считалось «моногенными заболеваниями» и синдромами, которые проявляются, поскольку на хромосомах не наблюдалось никаких отклонений, на самом деле обусловлено небольшими изменениями в хромосомах. Например, синдром WAGR, который считался генетическим заболеванием AD, обусловлен делецией фрагмента llpl4.1-p13; синдром Прадера-Вилли, который также считался генетическим заболеванием AD, в действительности обусловлен делецией и перестройкой 15q11.2. Например, причина врожденного дисгенеза была впервые установлена Weune (1959) как результат наличия лишней хромосомы 2l. Используя методы полосового анализа высокого разрешения, было установлено, что основной симптом врожденного дисгенеза связан только с дупликацией крошечного фрагмента 21q22.3. Применение методов полосового анализа высокого разрешения для изучения микроструктуры хромосом и генетических последствий структурных изменений также известно как микроцитогенетика. Сейчас возможно показать от 3 000 до 10 000 полос на хромосомах в гц или ранней профазе, что близко к количеству структурных генов, присутствующих в клетке (около 30 000), таким образом, сокращая расстояние между цитогенетикой и молекулярной генетикой.
Номенклатура хромосом высокого разрешения указывает на то, что в хромосомах высокого разрешения одна полоса на уровне 320 полос обычно может быть разделена на несколько полос — субполос. Что касается номенклатуры и представления субполос, ISCN (1981) утверждает, что субполосы любой из полос, названных в ISCN (1978), сохраняют свои оригинальные номера полос зон и пограничных маркеров, и что каждая полоса подразделяется путем добавления точки после оригинального номера полосы и написания номера каждой субполосы, при этом принцип нумерации остается последовательным от митотического конца к концу руки. Например, исходная полоса lp3l делится на три подполосы, которые следует записывать как lp31.1, 1p31.2 и 1p31.3.
Из них lp31.1 находится близко к митофагусу, а 1p31.3 — далеко от митофагуса. Если субполоса подразделяется на подполосы, за исходным номером подполосы может следовать цифра, но дальнейшая пунктуация не требуется. Например, если подразделяется субполоса 1p31.3, то она записывается как 1p31.3l, lp31.32 и lp31.33.
III. Прогресс в исследованиях в области цитогенетики человека
В целом, технология визуализации хромосом вышла на уровень визуализации хромосом с высоким разрешением, что значительно улучшило способность анализировать хромосомы, но под световым микроскопом она может идентифицировать только фрагменты ДНК размером более 4500 кб, в то время как хромосомные аномалии размером менее 4500 кб не могут быть распознаны. В настоящее время использование методов молекулярной биологии позволило эффективно выявлять и анализировать молекулы ДНК размером от нескольких десятков до 2 000 кб. Поэтому сочетание методов молекулярной биологии с микроцитогенетикой имеет большое значение для анализа причин генетических заболеваний и выявления генов, вызывающих болезни. Молекулярная цитогенетика — это изучение структуры хромосом и генетических последствий аберраций на молекулярном уровне с помощью методов молекулярной биологии, основанных на микроцитологии.
Молекулярная цитогенетика — это изучение структуры хромосом и генетических эффектов аберраций и развития заболеваний на молекулярном уровне, основанное на микроцитологии. Именно в этом направлении развивается цитогенетика человека.
Основными методами исследования в молекулярной цитогенетике являются следующие.
1, флуоресцентная гибридизация in situ (fluorescence in situ hybridization,: FISH) Эта техника была разработана на основе технологии гибридизации in situ, созданной в 1960-х годах. Преимуществами FISH являются быстрота, безопасность, экономичность, чувствительность и специфичность по сравнению с общими методами гибридизации in situ (ISH). Преимуществами FISH являются быстрота, безопасность, экономичность, чувствительность и специфичность. Зонды обнаруживаются с помощью нерадиоактивного флуоресцентного окрашивания в сочетании с антителами или белками, не требуется специальных мер предосторожности, образцы могут храниться в течение длительного времени без инактивации, а разрешение может составлять 100-200 кб, такое же или выше, чем у радиоактивных зондов. Поэтому методы FISH широко используются для обнаружения экзогенных генов, таких как локализация генов, хромосомные аберрации, амплификация генов и вирусы, интегрированные в клетки человека. Например, методы полосового анализа высокого разрешения показали, что причиной врожденного дисгенеза является дупликация крошечного фрагмента 2lq22.3, который можно вырезать с помощью методов микродиссекции, чтобы клонировать содержащийся в нем фрагмент ДНК и использовать флуоресцентно меченую ДНК в качестве зонда для проведения флуоресцентной гибридизации in situ на интерфазных клетках в ворсинах хориона или амниотической жидкости беременных женщин с высоким риском врожденного дисгенеза, для быстрой пренатальной диагностики врожденного дисгенеза. ДНК используется в качестве зонда для флуоресцентной гибридизации in situ на интерстициальных клетках ворсин хориона или амниотической жидкости беременных женщин с риском врожденного дисгенеза. Этот многоцветный метод FISH быстро развивался в последние годы и стал важным инструментом для локализации генов и диагностики генетических заболеваний.
2, флуоресцентная гибридизация ДНК волокон in situ (DNA fiber-FISH) Эта техника является недавно созданной визуальной технологией геномного картирования высокого разрешения, суть этой технологии заключается в том, чтобы сначала обработать тестируемые клетки щелочным раствором или раствором формальдегида, чтобы организация интерфазного ядерного хроматина освободила хроматин (нити) от ядерного скелета, чтобы подготовить ДНК волокна на слайде, а затем различные цвета. DNA fiber-FISH — это та же процедура, что и FISH анализ для выявления хромосомных аномалий, но преимущество первого заключается в более высоком разрешении (от 1 до 500 кб) и длине зонда в диапазоне от 1 до 300 кб. 300 кб. Поэтому технология DNA fiber-FISH широко используется в картировании генома человека, анализе структуры хромосом и анализе хромосомных заболеваний, опухолей и некоторых моногенных заболеваний.
Покрытие хромосом Покрытие хромосом представляет собой комбинацию методов FISH и гибридизации с подавлением хромосом на месте (CISS), где одноцепочечная ДНК и Cot-1 используются для закрытия повторяющихся последовательностей генома, чтобы уменьшить неспецифические гибридизационные сигналы и тем самым усилить гибридизацию, а специфические для хромосом библиотеки ДНК используются в качестве пулов зондов для покрытия целых хромосом или специфических для хромосом регионов с различной флуоресценцией.
Основным шагом в технике покрытия хромосом является маркировка хромосомно-специфической ДНК (целых хромосом или хромосомно-специфического региона) неизотопным веществом, например, биотином, который готовится как ДНК-зонд и затем гибридизуется in situ с хромосомой клетки-мишени, которая затем обнаруживается и усиливается реакцией антиген-антитело со стрептавидином против белка биотина с флуоресцентным веществом. Вся хромосома или хромосомный сегмент, подлежащий тестированию, может затем отображать флуоресцентный гибридизационный сигнал, на основании которого может быть поставлен диагноз. Например, для анализа микроскопических транслокаций с участием двух хромосом можно использовать дигоксигенин-1l-duTp и обычный биотин для раздельной маркировки двух хромосом, создавая два различных ДНК-зонда, которые могут быть гибридизованы, а затем обнаружены и усилены реакцией антиген-антитело, так что две хромосомы в одном кариотипе могут быть окрашены по-разному (например, одна красная, а другая зеленая), а взаимные транслокации образуют Две производные хромосомы, каждая из которых окрашена в красный и зеленый цвета, могут быть четко идентифицированы. Это позволяет предположить, что новая методика будет иметь широкий спектр применения и важное значение для анализа сложных транслокаций хромосом человека, цитогенетики опухолей и локализации генов.
4. Сравнительная геномная гибридизация (CGH) Каллионеми (1992) и Мануар (1993) создали метод CGH на основе метода FISH, который основан на маркировке геномной ДНК опухоли (исследуемой ДНК) и нормальной контрольной ДНК различными неизотопными маркерами, а затем смешивании их в соотношении 1:1 для получения зонда. Затем зонды смешиваются в соотношении 1:1 и гибридизуются in situ с нормальными хромосомами периферической крови для ингибирования, и зонды тестируются с различными флуоресцентными красителями. Опухолевая ДНК обычно окрашивается в зеленый цвет, а нормальная геномная ДНК — в красный. Относительное количество опухолевой ДНК, гибридизованной с хромосомным регионом, и нормальной контрольной ДНК зависит от содержания этой последовательности в двух образцах, что может быть определено путем визуального наблюдения разницы между двумя цветами в различных хромосомных регионах для определения относительного числа копий двух различных источников ДНК, или путем количественного определения соотношения красной и зеленой флуоресценции с помощью флуоресцентного микроскопа, подключенного к компьютеризированной системе анализа цветных изображений. Это также может быть использовано для количественной оценки соотношения красной и зеленой флуоресценции с помощью флуоресцентного микроскопа, подключенного к компьютеризированной системе анализа цветных изображений. Этот новый метод позволяет обнаружить и локализовать копии последовательностей ДНК между различными геномами на уровне всех хромосом или хромосомных поддиапазонов, а также определить происхождение некоторых компонентов опухолевых хромосом (например, двойных микросом, маркерных хромосом), которые трудно определить с помощью цитогенетических методов, а также обеспечивает быстрое обнаружение информации о хромосомных трисомиях, моносомиях или изменениях в числе копий больших сегментов хромосом, тем самым облегчая диагностику. Он также позволяет получить информацию о трисомных, гаплотипических или изменениях числа копий больших фрагментов хромосом, тем самым облегчая быструю диагностику таких состояний, как врожденная тупость и спонтанный аборт.