Глиомы являются наиболее распространенной опухолью в нейрохирургии и имеют плохие результаты. Иммунотерапия является эффективным биологическим методом лечения злокачественных глиом, причем иммунотерапия, опосредованная дендритными клетками (ДК), является широко используемым подходом для продления выживаемости пациентов с глиомами. Наше предыдущее исследование показало, что антигены стволовых клеток глиомы (цельные опухолевые антигены, полученные из стволовых клеток) более иммуногенны, чем традиционные антигены, а эффективность вакцин, приготовленных путем загрузки аутологичных ДК этим антигеном, была продемонстрирована как в исследованиях in vitro, так и на животных. Материалы и методы 1. Критерии отбора пациентов: пациенты с рецидивирующей глиомой, клинически диагностированной как рецидивирующая злокачественная глиома (патоморфологический класс ВОЗ III-IV); полное иссечение или резекция опухоли >80% (подтверждено послеоперационной расширенной МРТ); ожидаемая выживаемость >3 месяцев; долгосрочное качество жизни по шкале KPS (Karnofsky Performance Scale) ≥60 баллов для пациентов с глиомой. Пациенты со следующими гематологическими показателями: лейкоциты > 3 x 109/л, гемоглобин > 90 г/л; нормальная функция печени и почек (портальная аминотрансфераза и глутамат-аланин аминотрансфераза ≤ 2 раза выше верхней границы стандартного нормального значения, креатинин ≤ 150 мкмоль/л, азот мочевины ≤ 9 ммоль/л); согласие на участие в исследовании и подписание формы информированного согласия. Исследование было одобрено этическим комитетом больницы Хуашань, а соответствующие пациенты и их семьи были подробно проинформированы и подписали форму информированного согласия. 2. первичная культура клеток глиомы: свежие образцы опухоли были взяты во время операции, и первичная культура была выполнена in vitro. Этапы были кратко описаны следующим образом: свежие блоки ткани глиомы были промыты и разрезаны, переварены путем добавления 5-10-кратного объема 0,2% коллагеназы IV (Sigma) в инкубаторе при 37°C в течение 10 минут, центрифугированы и лизированы раствором для лизиса эритроцитов с хлоридом аммония, отфильтрованы через стальную сетку (размер пор 30 мкм) для получения суспензии отдельных клеток Клетки инокулировали в культуральную среду DMEM/F12 (20 нг/мкл bFGF, 20 нг/мкл EGF, 20 нг/мкл B27) при плотности 3×105 клеток/см2 и инкубировали в 5% CO2 инкубаторе при 37°C. Клетки меняли на 2-3 день, пассировали раз в неделю и наблюдали их морфологию под фазово-контрастным микроскопом. 3. сортировка CD133-положительных стволовых клеток: некоторые первичные культивированные клетки (от 5×107 до 1×108 клеток) были взяты для получения опухолевых моноцитов и помечены проточными антителами CD133/1 (Miltenyi Biotec) и антителами на магнитных бусинах соответственно в соответствии с инструкциями набора, и доля CD133+ клеток была определена с помощью проточной цитометрии и антител на магнитных бусинах CD133/1 ( Miltenyi Biotec) маркировка с последующей сортировкой. Магнитные бусы сортировали следующим образом: магнитные бусы CD133/1 инкубировали с клетками в течение 10 мин при 4°C, дважды промывали PBS; 500 мкл PBS использовали для ресуспендирования клеток и суспензию медленно пропускали через колонку; 1 мл PBS использовали для промывки колонки дважды, чтобы собрать CD133-клетки; магнитное поле удаляли и собирали CD133+ клетки, промывая PBS. CD133+ и CD133- клетки маркировали отдельно с помощью CD133+ и CD133- клетки анализировали с помощью проточной маркировки антителами CD133/2. 4. приготовление антигена, подобного стволовым клеткам, и вакцины DC: CD133+ клетки собирали после вышеуказанной сортировки, облучали рентгеном (6 Грей, линейный ускоритель Varian 600C, Шанхайская больница Гамма), собранные клетки многократно замораживали и размораживали в жидком азоте и на водяной бане 37°C три раза, многократно продували пипеткой, и супернатант, полученный после высокоскоростного центрифугирования, представлял собой раствор антигена, подобного стволовым клеткам глиомы. Концентрацию определяли с помощью стандартного белкового анализа Брэдфорда, корректировали до 1 мкг/мкл с помощью PBS и хранили при -20 ℃. Через 7 дней суспендированные DC-клетки собирали, маркировали проточным антителом CD11c, анализировали методом проточной цитометрии и дополнительно инкубировали с вышеуказанным антигеном. Совместное культивирование при 37°C в течение 18 ч (конечная концентрация антигена 150 мкг/мкл), экспрессия поверхностных молекул, таких как HLA-Ⅰ, HLA-Ⅱ, CD80 и CD86 на ДК была обнаружена после стимуляции антигеном [2], чтобы понять созревание ДК. Подсчитать после промывания физиологическим раствором и довести объем до 0,5 мл. 5. Лечение вакциной DC в сочетании с химиотерапией и определение соответствующих показателей: МРТ головы с усилением проводилась в течение 3 дней после операции для наблюдения за хирургической резекцией. Вакцина из опухолевых DCs, приготовленная вышеописанным методом, вводилась внутримышечно в треугольник в течение 4-8 недель после операции. Одна инъекция делалась каждые 1 неделю, в общей сложности 3 инъекции. Во время иммунотерапии наблюдайте за жизненными показателями, неврологическими симптомами и т.д. До (1-й забор крови) и после (3-я вакцинация) иммунотерапии было собрано 5 мл крови и проведен анализ крови на обычные показатели (включая количество лейкоцитов, соотношение лимфоцитов и т.д.), функцию печени и почек, содержание натрия, калия и кальция в крови на кафедре лабораторной медицины (аккредитованной Коллегией американских патологоанатомов) больницы Хуашань. После иммунотерапии была продолжена химиотерапия темозоломидом (TMZ) по схеме: TMZ 200 мг/м2 перорально в течение 5 дней, 28 дней в течение 1 цикла. После иммунотерапии проводилась расширенная МРТ головы и выживания с интервалом примерно в 3 месяца. Результаты 1. Краткое описание данных пациентов: Все пять пациентов соответствовали критериям включения и имели патологию злокачественной глиомы после вторичной операции. Послеоперационная расширенная МРТ подтвердила полную резекцию в 4 случаях и частичную резекцию в 1 случае. Три пациента получили радиотерапию и химиотерапию после первой операции, один пациент прошел локальное лечение на гамма-ноже, и один пациент не получал радиотерапию и химиотерапию. После 2-й операции все 5 пациентов получили иммунотерапию с 3 вакцинациями и химиотерапию темозоломидом. Подробная информация представлена в таблице 1. 2. CD133+ клетки в клетках глиомы: опухолевые клетки росли в суспензии сфероподобно в бессывороточной культуральной среде (рис. 1a), и опухолевые сферы были видны перекатывающимися при встряхивании культуральной колбы. Часть клеток была взята на 3-й день первичной культуры для получения суспензии одиночных клеток, и доля CD133+ клеток была определена методом проточной цитометрии после мечения антителом CD133-1/PE. Результаты показали, что все рецидивирующие глиомы у вышеуказанных пациентов содержали CD133+ клетки, но в разных пропорциях. Сортировка магнитных бусинок позволила увеличить долю CD133+ клеток в каждой клеточной линии глиомы в разной степени (Таблица 2).3. Критерии для приготовления вакцины на основе ДК: Стимуляция ДК антигеном, подобным стволовым клеткам, привела к увеличению экспрессии HLA, CD86 и других молекул на их поверхности, что свидетельствует о зрелости ДК[2], и большинство клеток при микроскопии были видны агрегированными, взвешенными и с пальцеобразными выступами, что характерно для зрелых ДК. Результаты проточного анализа показали, что чистота CD11c-положительных клеток достигла (80±6,34)% после индукции (Рисунок 1b-e), а количество клеток DCs могло достигать 3×106-5×106 (Таблица 2). 4. соответствующие показатели до и после иммунотерапии: не было существенной разницы в функции печени и почек и электролитах до и после иммунотерапии, и все они были в пределах нормы. Процент лимфоцитов в рутинной крови увеличился с (38±6,72) % до иммунотерапии до (44,6±8,61) %, но разница не была статистически значимой (n=5, P=0,0592). После вакцинации ДК у 5 пациентов 1 случай жаловался на головокружение, которое самостоятельно прошло в течение 24 часов. У всех пациентов не было головной боли, лихорадки, диареи, кожной сыпи, неврологических изменений, покраснения или отека в месте инъекции. У одного пациента с частичной резекцией опухоли была обнаружена глиобластома IV степени, и рецидив опухоли был подтвержден на МРТ и МРС через 15 недель после операции и через 7 недель после иммунотерапии. МРТ подтвердила остаточный рост опухоли на контралатеральной стороне, значительное уменьшение опухоли наблюдалось на 30 неделе после операции и на 22 неделе после иммунотерапии, но остаточная опухоль снова прогрессировала на 53 неделе после операции (Рисунок 2), и он умер на 57 неделе после операции от прогрессирования опухоли. С быстрым развитием иммунологии понимание иммунитета центральной нервной системы изменилось с «иммунно-привилегированного» на «иммунно-специальное»[4] . Иммунотерапия глиомы приобретает все большее значение. Высокозлокачественные глиомы обладают сильной способностью к иммунному побегу, и хирургическая резекция опухоли помогает уменьшить вызванную опухолью местную и системную иммуносупрессию[5]; гематоэнцефалический барьер вокруг глиомы часто проницаем из-за повышения уровня фактора роста эндотелия сосудов, повышенной экспрессии белка 4 водного гумора и разрушения плотных спаек, что облегчает проникновение системных иммунных клеток в мозг[4]. интерес к иммунотерапии глиомы. ДК — это наиболее мощные специализированные антигенпрезентирующие клетки, способные поглощать, обрабатывать и доставлять антигены, обладающие мощной способностью активировать Т-клетки, участвовать в иммунном ответе in vivo и занимать центральное место в иммунном ответе на опухоль. Для усиления иммунного ответа организма опухолевые антигены часто вводятся в ДК in vitro для стимуляции иммунного ответа против опухолевых клеток, т.е. вакцины против опухолевых ДК. Преимущества включают: (1) специфическое распознавание опухолевых клеток, сильное прицеливание и низкий уровень побочных эффектов; (2) сочетание с радиотерапией и химиотерапией может дать лучшие результаты, чем одиночная терапия; (3) клетки памяти, образующиеся во время иммунотерапии, могут помочь предотвратить рецидив. Сенсибилизированные DC-клетки, значительно продлили выживаемость пациента, с инфильтрацией CD8+ Т-клетками и клетками памяти в реоперационных образцах опухоли. В Китае Сюэ Делин и другие [7] прививали пациентам с глиомой вакцину из ДК, приготовленную из гомогенатов опухолевой ткани, что также увеличило выживаемость пациентов. Тем не менее, отсутствие специфических для глиомы антигенов ограничивает дальнейшее развитие иммунотерапии глиомы. Хотя глиомы экспрессируют множество соответствующих антигенов, таких как вариант EGFR, IL-13R и тенасцин [4], вышеупомянутый антиген не является широко экспрессируемым антигеном глиомы. В настоящее время признано, что сенсибилизация ДК смешанными опухолевыми антигенами является одним из более безопасных и эффективных методов лечения глиомы [5], однако смешанные антигены сами по себе имеют недостаток, заключающийся в слабой антигенности. В нашем предыдущем исследовании мы обнаружили, что смешанные опухолевые антигены, полученные из стволовых клеток глиомы, т.е. антигены, подобные стволовым клеткам, были более иммуногенными, чем обычные антигены [2]. Вакцины на основе ДК, сенсибилизированные антигеном из стволовых клеток, в настоящее время доступны только в экспериментах in vitro [2] и в исследованиях на животных-мышах [3] (где антиген из стволовых клеток был получен из несортированных клеток), а клинические исследования в настоящее время отсутствуют. Исходя из этого, в данном исследовании изучалась осуществимость, безопасность и эффективность вакцины DC, сенсибилизированной антигеном стволовых клеток глиомы, у пациентов со злокачественной глиомой. Все пациенты, включенные в данное исследование, имели рецидивирующие и послеоперационные патологически подтвержденные злокачественные глиомы. Для лечения злокачественных глиом предпочтительно хирургическое вмешательство, а иммунотерапия в качестве послеоперационной адъювантной терапии подходит для микроскопических поражений или рассеянных опухолевых клеток. Сообщалось также, что темозоломид продлевает выживаемость пациентов с глиомой [8], а вакцины могут повышать эффективность химиотерапии глиомы [9], поэтому мы объединили эти два метода. Однако, поскольку химиотерапия значительно снижает количество лейкоцитов, иммунотерапию рекомендуется проводить до начала химиотерапии. В этом исследовании у пациентов с рецидивом глиомы, получавших вакцину ДК, не было значительных побочных эффектов, аутоиммунитета и т.д. Выживаемость двух пациентов III степени составила 72 недели и 75 недель, а трех пациентов IV степени — 57 недель, 77 недель и 80 недель, при средней продолжительности выживания 72,2 недели. последующие работы и данное исследование все еще продолжаются. yU et al[10] изучили среднюю выживаемость группы пациентов, получавших вакцину ДК около 133 недели; в контрольной группе была рецидивирующая глиома, и средняя выживаемость составила около 33 недель после операции и радиотерапии. Zhang X. S. [5] обобщил данные литературы и установил, что в настоящее время выживаемость после операции по поводу рецидивирующей глиомы составляет около 25, 7 недель. Это показывает, что модифицированная вакцина DC в данном исследовании была безопасной и эффективной, и что вакцина DC в сочетании с химиотерапией темозоломидом продлила выживаемость пациентов. Несмотря на эффективность иммунотерапии глиомы, все существующие DC-вакцины имеют определенные недостатки, и повысить их эффективность пока сложно. Кроме того, необходимо приложить усилия для рационализации процесса и их индустриализации. В связи с ограниченным количеством случаев, приведенных в данной работе, безопасность и эффективность DC-вакцин для лечения глиомы требуют более тщательного и всестороннего наблюдения.