Бесплодие и низкий рост — две основные проблемы людей с синдромом Тернера (СТ). В последние 20 лет для лечения низкорослости используется рекомбинантный гормон роста (гормон Грота, ГР), который позволяет большинству людей с ТС достичь роста взрослого человека на уровне или чуть ниже нижней границы нормальной популяции. Поскольку преждевременная недостаточность яичников является классическим симптомом заболевания, донорство яйцеклеток и сохранение оставшихся яйцеклеток стало одним из эффективных методов лечения бесплодия.
У 15-30% пациентов с ТС происходит спонтанное половое созревание, но только 2-5% из них могут забеременеть, что позволяет предположить, что фолликулы у пациентов с ТС вырабатывают эстроген, но исчезают преждевременно, а динамический процесс исчезновения до конца не выяснен. В одном из предыдущих исследований у девочек с ТС была взята биопсия, заморожена и проанализирована ткань коры яичников на предмет наличия фолликулов, и фолликулы были обнаружены у 8 из 10 девочек-подростков. В настоящее время криоконсервация ткани коры яичников перед противораковым лечением у молодых онкопациенток с требованиями к фертильности используется как вариант сохранения примордиальных фолликулов для будущего лечения бесплодия, а при трансплантации замороженной-размороженной ткани яичников было получено здоровое потомство.
Целью данного исследования было прогнозирование фертильности пациенток с ТС путем замораживания ткани яичников и ее клинической и гормональной оценки, включая возраст, кариотип, спонтанные менструации, уровень пубертатного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ) и гранулоцитарного антимиллерова гормона (АМГ).
Клинические данные
В исследование были включены 57 пациентов с ТС в возрасте 8-19,8 лет, направленных 25 детскими эндокринологами Швеции (в основном Стокгольма и Сконе на юге страны). Пациенты и их родители были проинформированы о деталях исследования и подписали форму информированного согласия. Пациенты и семьи были подробно проинформированы о том, что невозможно предсказать, будет ли полученная ткань яичников содержать яйцеклетки для будущего лечения бесплодия, и что существуют другие варианты создания семьи, такие как донорство яйцеклеток и усыновление, и большинство семей приняли это предложение и вошли в исследование.
Только 15 человек в медицинском центре с наибольшим числом пациентов отказались присоединиться к исследованию. Мы считаем, что у пациенток с признаками преждевременной недостаточности яичников также вероятно обнаружение фолликулов, поэтому ни одной пациентке не было отказано в участии. Исследование было одобрено Комитетом по этике Каролинского института и проводилось в строгом соответствии с Хельсинкской декларацией и шведским законом об этике медицинских исследований.
За исключением семи девочек младше 12 лет, у 19 из 50 девочек были признаки спонтанного начала полового созревания, у 13 (26%) — менархе, а 21 девочка проходила курс HRT. Никакие исследования еще не подтвердили минимальный объем яичников, при котором можно обнаружить фолликулы, поэтому перед проведением исследования не проводилось УЗИ или магнитно-резонансная томография (МРТ). Пациентки получали гормон роста человека (ГР), тироксин (Т4) и заместительную терапию эстрогенами (ЗГТ) в соответствии со шведскими протоколами лечения.
Анализ хромосом лимфоцитов определил диагноз TS, который был 45X в 28 случаях, химерный в 7 случаях (45X/46XX/47XXX) и структурные аномалии (СА) на одной из Х-хромосом в остальных 22 случаях, включая делеции длинного или короткого плеча, гетерохромосомы, кольцевые хромосомы или фрагменты Y. Результаты хромосомного анализа предоставлялись медицинским центром, в котором наблюдался пациент, а количество проанализированных клеток варьировалось от 15-105 в зависимости от времени и места проведения анализа.
Уровень детализации отчетов генетических лабораторий также различается, в некоторых отчетах даже отсутствует подробная информация о делеции или дупликации Х-хромосомы. Все результаты хромосомного анализа были получены из культур лимфоцитов, также сообщалось о некоторых результатах анализа флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) клеток слизистой оболочки буккальной области или других тканей.
Методы
Лапароскопия
Пациенткам проводилась лапароскопическая биопсия под общей анестезией для получения ткани яичников для замораживания. У 10 девочек яичники были слишком полосатыми или слишком маленькими для биопсии, или их даже трудно было определить. У остальных 47 пациенток была взята биопсия 25-50% кортикальной ткани одного яичника.
Криоконсервация
Извлеченную ткань яичника немедленно помещали в культуру для оплодотворения in vitro, содержащую буфер HEPES и человеческий сывороточный альбумин. 0,5-3 мм3 коры яичника вырезали для гистологической биопсии, а оставшуюся ткань разрезали на небольшие полоски, приблизительно 0,5 х 3-5 мм, и замораживали путем медленного программирования с криопротектором пропиленгликоль-сахароза.
Гистологическая биопсия и подсчет фолликулов
Небольшой кусочек свежей ткани яичника от каждой пациентки был вырезан и зафиксирован в растворе Буэна, парафинирован, секционирован и окрашен гематоксилином и эозином. Общее количество фолликулов и плотность фолликулов в биопсированных образцах оценивали с помощью системы анализа изображений, подключенной к инвертированному микроскопу. Плотность фолликулов выражалась как количество фолликулов на кубический миллиметр в анализируемых образцах, при этом учитывались только нормальные фолликулы. Обычно плотность фолликулов у здоровых девочек превышает 500/мм3.
Измерения гормонов
Образцы крови на ФСГ, ЛГ и АМГ были взяты за день до лапароскопической биопсии в 28 случаях, 19 образцов крови были отправлены в течение года после биопсии, а в остальных 10 случаях образцы крови отсутствовали.
Сывороточные ФСГ и ЛГ были измерены у 47 пациенток, 43 — с помощью твердофазного двухсайтового хемилюминесцентного иммуноферментного анализа (Immulite) в лаборатории исследований женского здоровья Каролинского института. ЛГ, пролактин, человеческий ГР или человеческий плацентарный лактоген (ЧПЛ) без выявления перекрестной реактивности.
Чувствительность анализа ЛГ составила 0,1 мМЕ/мл, специфичность также была очень высокой, при этом перекрестная реактивность с ХГЧ, ФСГ или ТСГ не была обнаружена. Чувствительность анализа ФСГ составила 0,7 мМЕ/мл, при этом критический уровень, широко используемый в Европе, соответствует концентрации 17 МЕ/л. Широко используемый в США стандарт был откалиброван в соответствии со вторым международным эталонным препаратом (IRP) для биологического анализа ФСГ и ХГЧ ВОЗ. Он откалиброван по второму стандарту IRP.
Концентрация АМГ была определена в 43 детских сыворотках в Исследовательской лаборатории женского здоровья, Каролинский институт, Швеция, с использованием двухступенчатого набора AMH ELISA. Использовался сверхчувствительный протокол, рекомендованный производителем. Этот метод обладает очень высокой специфичностью для обнаружения АМГ и не имеет перекрестной реактивности с TGF-β. Чувствительность определялась как наименьшая концентрация АМГ, которая значительно отличалась от нулевого стандарта с вероятностью 95% и составляла 0,7 пмоль/л.
Статистика
Чувствительность и специфичность диагностического теста используются для расчета положительной и отрицательной прогностической ценности соответственно. Положительная прогностическая ценность — это доля пациентов с положительным результатом теста и отражает чувствительность теста. Отрицательная прогностическая ценность — это доля непациентов с отрицательным результатом теста и отражает специфичность теста. Результаты выражались в виде кривых ROC (кривая операционной характеристики приемника) и статистически обрабатывались с помощью теста χ2, при этом P<0,05 указывало на статистически значимую разницу.
Результаты
Лапароскопия
Все 57 лапароскопий были дневными процедурами, т.е. пациенты поступали утром и выписывались днем или вечером, и в этом исследовании не было анестезиологических или хирургических осложнений.
ЛГ, ФСГ и АМГ
Всем пациенткам была проведена биопсия без HRT в 36 случаях, HRT проводилась в 21 случае. Измерения гормонов не проводились в связи с артефактом измерения ХГЧ. ЛГ и ФСГ были измерены в 30 случаях. В 17 случаях показатели сывороточного ЛГ и/или ФСГ были выше нормы для их возраста, из них в 13 случаях в биоптате не было обнаружено фолликулов, а в остальных 4 случаях фолликулы были обнаружены; в 13 случаях показатели гормонов были в пределах нормы для их возраста, из них в 9 случаях были обнаружены фолликулы, а в 4 случаях фолликулы отсутствовали.
Яичники с яйцеклетками
Из 57 пациенток у 47 можно было провести биопсию одного яичника, и у 15 (26% от общего числа) были обнаружены фолликулы в диапазоне 0,7-1200/мм3. 6 из 7 химер (86%) имели видимые фолликулы, 6 из 22 СА (27%) имели фолликулы и 3 из 28 кариотипов 45Х (10,7%) имели фолликулы. 19 пациенток со спонтанными пубертатными признаками У 11 (58%) из 19 пациентов со спонтанным половым созреванием были фолликулы, а у 8 (62%) из 13 спонтанных менструаций были фолликулы.
Из 30 пациентов старше 12 лет без спонтанного полового созревания у трех (10%) были обнаружены фолликулы. У одной 11-летней девочки были обнаружены фолликулы, несмотря на отсутствие явных пубертатных признаков.
Пять лучших положительных прогностических значений (чувствительность) для прогнозирования наличия фолликулов были следующие: кариотип как химерный (0,86), значение ФСГ 11 мМЕ/мл (0,69), AMH2 пмоль/л (0,64), спонтанное менархе (0,62) и спонтанное наступление пубертата (0,58).
Отрицательные прогностические значения (специфичность) для отсутствия фолликулов были следующими: кариотип 45X (0,89), AMH2 пмоль/л (0,88), отсутствие спонтанного начала полового созревания (0,87), младше 12 лет (0,82), отсутствие спонтанного менархе (0,81), значение FSH 15 mIU/ml (0,77), старше 16 лет (0,76), кариотип SAs (0,73). ). Пять из шести вышеперечисленных факторов были статистически значимыми, при этом фактор возраста не был значимым, хотя отрицательная прогностическая ценность была выше для самой молодой возрастной группы.
Заключение
Результаты данного исследования свидетельствуют о наличии 5 важных факторов для способности обнаружить фолликулы в яичниках девочек с ТС: кариотип, низкий уровень ФСГ, высокий уровень АМГ, спонтанное менархе и спонтанное половое созревание. В заключение следует отметить, что следующие группы девочек с ТС имеют самые высокие шансы на наличие фолликулов и могут быть рассмотрены для проведения лапароскопической биопсии ткани яичников для замораживания в возрасте 13-17 лет: 1) химерные (45X/46XX/47XXX); 2) со спонтанным половым созреванием и 45X или 45X/46X+ СА; и 3) с нормальным уровнем ФСГ и/или АМГ в сыворотке крови со спонтанным половым созреванием или без него.
Если предположить, что вышеуказанные 3 критерия использовались для прогнозирования пациентов в данном исследовании, то 19 случаев должны были пройти лапароскопию в том же возрасте, из них 11 с выявляемыми фолликулами и 8 без фолликулов, с чувствительностью 0,58 (9/11). 15 из более молодых пациентов, откладывая лапароскопию, имели 2 случая, в которых фолликулы все еще могли быть обнаружены позже, так как оба имели пубертатные признаки. 23 пациента, которым не была проведена лапароскопия. 2 случая с фолликулами могли быть пропущены в соответствии с третьим критерием. Специфичность для исключения девочек с ТС без фолликулов должна составлять 0,91 (21/23).
Обсуждение
Неудивительно, что фолликулы могут быть обнаружены у большинства пациентов с ТС со спонтанным половым созреванием и химеризмом. Неожиданно, но фолликулы также присутствовали у трех пациенток без спонтанного полового созревания и у четырех пациенток с высоким уровнем ФСГ, ЛГ и низким уровнем АМГ. Процесс фолликулярной атрезии и повышение концентрации гонадотропина в яичнике, по-видимому, происходили одновременно, по крайней мере, у некоторых людей, и в трех случаях с фолликулами, по крайней мере, имелась функция яичников, но не было признаков полового созревания, что предполагает, что их маленькие фолликулы не могли выделять достаточное количество эстрогена, чтобы вызвать начало полового созревания.
С другой стороны, у двух пациенток с нормальным уровнем гонадотропинов в сыворотке крови и АМГ >2 пмоль/литр не было обнаружено фолликулов, поэтому возможно, что фолликулы отсутствовали в небольших образцах, использованных для гистологического анализа, но присутствовали в замороженной ткани яичника или других частях яичника, которые, как известно, непостоянны в своем распределении в яичнике. Аналогичным образом, фолликулы не были обнаружены в четырех случаях с нормальным уровнем гонадотропинов и в четырех случаях с высоким уровнем АМГ.
УЗИ или МРТ малого таза не требовалось для подтверждения наличия или отсутствия яичников перед проведением лапароскопии в данном исследовании. Некоторые из девочек прошли трансабдоминальное ультразвуковое исследование в местной больнице, но результаты и совпадение с результатами лапароскопии были минимальными.
Предыдущие исследования также предположили, что результаты трансабдоминального УЗИ являются надежными при наличии особого интереса у исследователя, специальной подготовки и хорошего оборудования. МРТ может быть лучшим методом обнаружения ткани яичников в клинической практике и может быть вариантом, если лапароскопическая биопсия яичников не подходит пациенткам в соответствии с вышеуказанными критериями. 2 случая в исследовании, когда фолликулы были пропущены из-за несоответствия вышеуказанным критериям, могли быть диагностированы с помощью МРТ.
Необходимо рассмотреть вопрос о необходимости проведения биопсии, когда девочка с ТС достигает 13 или 14 лет, хотя статистически значимой разницы между возрастом и способностью обнаружить фолликулы нет. Большинство пациентов, достигших этого возраста, уже понимают возможности и ограничения сохранения ткани яичников на будущее, а поскольку опыт использования сохраненных клеток для лечения бесплодия ограничен, необходимо информировать пациентов о том, что нет гарантии, что в будущем у них будет биологическое потомство.
Поскольку беременность у пациентов с ТС может повысить риск осложнений, этот вопрос следует обсудить с пациенткой и ее родителями и проинформировать ее о том, что ее беременность потребует особого контроля со стороны акушера. У женщин с аномалиями сердца (аортальная недостаточность или аортальный стеноз) или гипертонией значительно повышен риск развития фатальных аневризм коарктации аорты, однако необходимы дальнейшие исследования.
Существует мало литературы о том, существует ли повышенный риск хромосомных аномалий у потомства пациентов с ТС, поэтому оценка этого риска пока не является надежной. Хотя пациентки с ТС были подробно проинформированы, как устно, так и письменно, об ограниченном доступе к потомству и различных известных и неизвестных рисках будущих беременностей, таких девочек легко привлечь к исследованию, поскольку пациентки, похоже, готовы сделать все возможное, лишь бы лечение бесплодия было технически возможно в дальнейшем. Начиная с 13-14 лет, такие пациентки сами могут стать активными участниками исследования, в то время как в случае с девочками младшего возраста окончательное решение должны принять их родители.
После успешного экстракорпорального оплодотворения замороженных фолликулов все женщины с ТС должны пройти преимплантационную генетическую диагностику (ПГД), взятие проб ворсин хориона или амниоцентезное кариотипирование во время беременности, если позволяют условия. Опыт данного исследования подтверждает нашу уверенность в том, что биопсия и хранение яичников в молодом возрасте у пациенток с ТС является очень важным шагом вперед в лечении бесплодия в этой популяции.