В последние годы, по мере активизации исследований в области технологии инженерии костной ткани для лечения костных дефектов, активизировались и исследования в области семенных клеток костной ткани, особенно сосудистых эндотелиальных прогениторных клеток. В данной статье рассматривается ход исследований по происхождению, биологическим свойствам, механизму улучшения сосудистого неогенеза, роли в восстановлении костей, лечении и применении сосудистых эндотелиальных прогениторных клеток.
Восстановление костной ткани — это сложная патофизиологическая деятельность, в которой участвуют различные клетки и внеклеточный матрикс, и которая регулируется различными факторами роста и гормонами. В последние годы методы инженерии костной ткани стали основным направлением исследований в области восстановления дефектов костей, при этом большая часть исследований сосредоточена на отборе и культуре затравочных клеток. Об эндотелиальных прогениторных клетках (EPCs) впервые сообщил Асахара в 1997 г. Это открытие обновило традиционную теорию постнатального ангиогенеза и восстановления повреждений сосудов, а также позволило по-новому взглянуть на лечение ишемических заболеваний.
1. происхождение ЭПК
В настоящее время общепризнано, что EPC и гемопоэтические стволовые клетки происходят от общей стволовой клетки — гемангио-гиобласта. Хотя определение и происхождение EPC все еще вызывает споры, большинство исследований показывают, что EPC в основном получают из крови пупочной вены, периферической крови взрослых и костного мозга, причем EPC в периферической крови происходят из костного мозга, а EPC в пупочной крови — из печени плода. В нормальных условиях количество EPC очень мало, около 2-3/мл в периферической крови и примерно в 3,5 раза выше в пуповинной крови. Они могут пролиферировать и увеличиваться в большом количестве в условиях культуры, подходящих для роста EPC, таких как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактор роста фибробластов (FGF). Asahara et al[1] сообщили, что EPCs — это группа клеток с блуждающими характеристиками, включая CD34, CD133, VEGF, фактор роста фибробластов (FGF), FGF и др. Asahara et al[1] сообщили, что EPC представляют собой группу клеток-предшественников с блуждающими характеристиками, положительными для поверхностных маркеров, таких как CD34, CD133 и VEGFR-2+, и могут пролиферировать и дифференцироваться в сосудистые эндотелиальные клетки после культуры in vitro. Они не только участвуют в эмбриональном ангиогенезе, но и существуют в пуповинной крови, периферической крови и костном мозге, оказывают сильный проангиогенный эффект во время постнатального ангиогенеза и формируют неоваскулярные EPC ангиогенным путем.
2. Биологические свойства EPC
2.1 Поверхностные маркеры ЭПК
Специфического поверхностного маркера для идентификации EPCs не существует, но большинство ученых считают, что CD34+ клетки являются общими прогениторными клетками гематопоэтических стволовых клеток и эндотелиальных прогениторных клеток. MAPC) является источником EPC. Они могут дифференцироваться в CD34+, CD133+, VEGFR-2+ и Flk1+ ангиогенные клетки в ответ на VEGF, FGF и IGF-Ⅰ и могут продолжать дифференцироваться в зрелые сосудистые эндотелиальные клетки, что делает их важным источником эндотелиальных клеток.
Первые исследования определили EPC как клетки, которые экспрессируют поверхностный маркер гемопоэтических стволовых клеток CD34 и поверхностный маркер эндотелиальных клеток — рецептор фактора роста эндотелия сосудов-2 (VEGFR-2). Впоследствии Пейчев и др. обнаружили, что антиген CD133 присутствует только в сосудистых эндотелиальных клетках-предшественниках и что зрелые эндотелиальные клетки не экспрессируют CD133; поэтому они назвали клетки, экспрессирующие CD34+, VEGFR-2+ и CD133+, функциональными сосудистыми эндотелиальными прогениторными клетками. Харраз и др. в ходе своих экспериментов обнаружили, что CD34-клетки постепенно дифференцируются в эндотелиальные клетки в кондиционированных культурах (культурах, в которых культивировались CD34+ клетки), и поэтому сделали вывод, что CD34+ клетки секретируют определенные неизвестные факторы, стимулирующие дифференцировку CD34-клеток в эндотелиальные клетки.
Rehman et al. сообщили, что МСК костного мозга и CD34-CD14+ моноциты также могут образовывать функциональные сосудистые эндотелиальные клетки in vitro после индукции VEGF и другими факторами. Также сообщалось об индуцированной дифференциации эндотелиальных клеток из мононуклеарных макрофагов.
2.2 Мобилизация ЭОС
Мобилизация прогениторных клеток в костном мозге диктуется местной средой. Мобилизация таких цитокинов, как эластаза, гистон G и семейство матриксных протеаз (MMPs), препятствует взаимодействию между стволовыми клетками и стромальными клетками, устраняя связывание адгезий на стромальных клетках, с действием интегринов гематопоэтических стволовых клеток, что в конечном итоге позволяет стволовым клеткам покинуть костный мозг посредством трансэндотелиальной миграции.
Физиологически считается, что ишемия может быть сигналом, вызывающим мобилизацию EPC костного мозга. Таким образом, ишемия может повышать уровень VEGF, высвобождать его в циркуляцию и вызывать мобилизацию клеток-предшественников костного мозга через зависимость от MMP-9. В гематологии были выявлены другие факторы, включая мобилизацию стволовых клеток костного мозга, например, забор гематопоэтических стволовых клеток из периферической крови для трансплантации костного мозга. Кроме того, эритропоэтин (ЭПО) может стимулировать пролиферацию и созревание эритропоэтических клеток, а у мышей и людей также может увеличить количество эндотелиальных прогениторных клеток в периферической крови. Связь между уровнем ЭПО в сыворотке крови и уровнем CD34+ или CD133+ стволовых клеток в костном мозге пациентов с ишемической болезнью сердца подтверждает важную роль эндогенного уровня ЭПО как физиологического показателя мобилизации EPC.
Однако остается неясным, какой фактор мобилизации наиболее важен для увеличения количества EPC. В исследованиях на животных VEGF165 быстро мобилизовал гемопоэтические стволовые клетки и циркулирующие эндотелиальные клетки-предшественники, тогда как ангиопоэтин-1 (ANG-1) вызывал отсроченную, более слабую мобилизацию эндотелиальных и гемопоэтических клеток-предшественников. Кроме того, первые доказательства фармакологической модуляции уровня EPCs были получены в результате исследований с использованием атеропротекторного препарата ингибиторов МГ-КоА-редуктазы (статинов).
Исследования показали, что статины увеличивают количество и функциональную активность EPCs у мышей и пациентов со стабильной болезнью коронарных артерий in vitro. Статины могут увеличить количество стволовых клеток в костном мозге, увеличить количество EPCs и улучшить функцию EPCs, включая пролиферацию EPCs, мобилизацию EPCs и предотвращение старения и апоптоза EPCs.
2.3 Дифференциация ЭПК
Koyanagi и др. обнаружили, что кальмодулин E и N экспрессируются на поверхности контакта ЭПК с кардиомиоцитами в системе ко-культуры, и что блокирование кальмодулина E ингибирует трансдифференцировку ЭПК, что указывает на влияние межклеточных взаимодействий на трансдифференцировку ЭПК. Аналогичным образом, понятие трансдифференцировки в кардиомиоциты недавно было поставлено под сомнение, поскольку Sales et al. показали, что EPC, индуцированные TGF-ß1 in vitro в течение 10-15 дней, могут перейти от эндотелиального фенотипа (CD31+/vWF+/αSMA-) к мезенхимальному фенотипу (CD31+/α-SMA+), секретируя при этом ламинин, фибронектин и коллаген I и III типов. Однако необходимы дальнейшие исследования для подтверждения того, что ЭПК трансдифференцированы в МСК, а не получены из клеток-предшественников МСК, которые могут быть смешаны с ЭПК или путем слияния клеток. EPC экспрессировали больше маркеров гладкомышечных клеток, чем зрелые эндотелиальные клетки, и были индуцированы к дифференцировке в гладкомышечные клетки различных фенотипов (сократительные или синтетические) с помощью PDGF-BB, что позволяет предположить, что они также могут дифференцироваться в сосудистые гладкомышечные клетки.
Все эти исследования позволяют предположить, что судьба EPCs не обязательно линейна, а может идти по другим путям дифференцировки при определенных условиях, то есть «состояние EPCs», разделяемое различными клетками, динамично и нестабильно, и может изменяться на другие состояния стволовых (прогениторных) клеток под воздействием внешних факторов среды, а также дифференцироваться в ЭПК динамичны и нестабильны.
3. Роль EPCs в восстановлении костной ткани
3.1 Механизмы, с помощью которых EPC улучшают ангиогенез
Хотя роль EPCs в ангиогенезе была продемонстрирована, остается открытым вопрос о том, как EPCs способствуют ангиогенезу. В отсутствие повреждения тканей роль прогениторных клеток слаба, но в ишемизированных тканях генетически меченные клетки, полученные из костного мозга, могут коэкспрессировать маркерные белки для ЭК с широким разбросом их воздействия (от 0% до 90%). Аналогичным образом, какова роль клеток, полученных из костного мозга, в постинсультной ткани мозга? Сообщения в литературе значительно различаются.
В двух исследованиях, одно из которых привело к тому, что в среднем 34% положительных клеток, полученных из костного мозга, экспрессировали эндотелиальные маркеры, в то время как в другом исследовании не удалось обнаружить клетки, экспрессирующие эндотелиальные маркеры, при этом большое их количество (50%) было обнаружено в основном в моделях опухолевого ангиогенеза. В некоторых исследованиях вблизи кровеносных сосудов обнаруживались только клетки, полученные из костного мозга, но они не экспрессировали белки-маркеры эндотелия. Одно из возможных объяснений заключается в том, что модель ишемии (например, степень повреждения или ишемии) существенно влияет на роль этих клеток. Умеренная ишемия едва ли может вызвать мобилизацию эндотелиальных прогениторных клеток, но только небольшое количество прогениторных клеток костного мозга побуждает их к действию. Эффекты трансплантации клеток также могут различаться в зависимости от субпопуляции клеток (например, чистые гемопоэтические стволовые клетки против клеток костного мозга). Действительно, внутривенная инфузия очищенных мононуклеарных клеток костного мозга или расширенных эндотелиальных прогениторных клеток дает лучшие результаты, чем внутренняя мобилизация пересаженных клеток костного мозга.
Tie-2-положительные клетки, полученные из костного мозга, могут блокировать опухолевый ангиогенез путем активации генов самоубийства, и хотя эти клетки интегрируются в сосудистую сеть опухоли, их можно обнаружить в непосредственной близости от сосудистой сети. Таким образом, EPC могут действовать аналогично моноцитам или макрофагам, поскольку они могут усиливать ангиогенез, выделяя цитокины и факторы роста. Исследования показали, что культивированные EPC различного происхождения могут экспрессировать факторы роста, такие как VEGF, HGF и IGF-1. Адгезивные моноциты могут культивироваться в аналогичных условиях и выделять VEGF, HGF и G-CSF, но не могут экспрессировать эндотелиальные маркерные белки; EPC могут быть включены в структуру неоваскуляризации, что позволяет предположить, что они участвуют в экспрессии эндотелиальных маркерных белков in vivo; тогда как макрофаги, которые также могут выделять факторы роста, но не могут быть включены в сосудистую структуру, могут вызывать лишь небольшое увеличение неоваскуляризации постишемической ткани. Было вызвано небольшое увеличение постишемической неоваскуляризации тканей.
Вышеуказанные исследования не подтвердили способность EPCs участвовать в формировании сосудоподобных структур in vivo, но они улучшили состояние неоваскуляризации.
3.2 Роль EPCs в восстановлении костной ткани
EPC могут участвовать в неоваскуляризации и обновлении эндотелиальных клеток посредством таких механизмов, как интеграция, слияние и паракринная секреция, и выступать в качестве затравочных клеток в тканевой инженерии, способствуя васкуляризации костной ткани in vivo. Три основных процесса после костной пластики — это васкуляризация трансплантата, регенерация кости и сращение концов кости, из которых васкуляризация является ключевым компонентом, действующим на протяжении всего процесса восстановления трансплантата и определяющим способ и эффект регенерации кости и сращения. После создания in vitro тканеинженерной кости, особенно в больших объемах, необходимо быстро наладить адекватное кровоснабжение для доставки клеток-предшественников остеобластов, сопутствующих факторов, питательных веществ и других клеток, участвующих в восстановлении кости, в местную микросреду и для удаления метаболических отходов и продуктов некроза и распада, обеспечивая питательные вещества для выживания и развития затравочных клеток и поддерживая физиологическую среду, благоприятную для этого процесса в целом. Метаболическая микросреда поддерживается в целом для облегчения этого физиологического процесса.
Основной подход к инженерии костной ткани заключается в инокуляции затравочных клеток с рассасывающимся биоматериалом для формирования комплекса клетка-скаффолд для имплантации в организм. По мере деградации материала скаффолда затравочные клетки продолжают пролиферировать и дифференцироваться, выделять матрикс и цитокины, тем самым ускоряя восстановление костных дефектов. В настоящее время существует множество исследований, направленных на развитие васкуляризации in vivo в тканеинженерной кости. К наиболее распространенным из них относятся: метод обернутого сосудистого пучка, инкапсуляция мышц, предварительно сконструированных с сосудистыми кончиками, метод обертывания фасции сосудистого кончика, композитные сосудистые эндотелиальные клетки-предшественники или сосудистые эндотелиальные клетки, а также 3D структурная модификация материалов скаффолда для облегчения васкуляризации и трансфекции генов и методы медленного/контролируемого высвобождения проангиогенных биологически активных факторов. Было установлено, что использование мобилизации гранулоцитарного колониестимулирующего фактора эффективно для увеличения количества циркулирующих EPC и улучшения эндотелизации искусственных материалов имплантатов. Исследования также показали, что EPC могут быть использованы в качестве затравочных клеток в тканевой инженерии, чтобы способствовать васкуляризации in vivo в тканевой инженерии и способствовать восстановлению кости.
3.3 EPCs в восстановлении костей для лечения и применения
Тканевая инженерия — это просто культивирование in vitro функционально значимых клеток, выращенных на натуральных или синтетических подложках, с целью получения новых функциональных тканей и органов, но большинство тканей и органов требуют наличия микрососудистой сети для доставки питательных веществ и отвода метаболитов.
Шмидт и др. выделили и культивировали эндотелиальные прогениторные клетки из пуповинной крови человека и инокулировали их вместе с гладкомышечными клетками сосудов человека на строительный каркас и обнаружили, что они могут формировать капилляроподобные структуры в сополимерах полигликолевой кислоты с полимолочной кислотой. Шультхайс и др. создали тканеинженерный мочевой пузырь путем инокуляции гладкомышечных клеток и эпителиальных клеток мочевого пузыря в децеллюляризированные сегменты тонкой кишки свиньи, которые сохранили свою сосудистую структуру. В важной области исследований тканевой инженерии, исследования костной ткани дали захватывающие результаты по нескольким направлениям и были использованы в первых клинических применениях, и считаются одной из самых перспективных и жизнеспособных областей тканевой инженерии.
Эти экспериментальные исследования показывают, что использование прогениторных клеток эндотелия сосудов для построения тканеинженерной кости является перспективным и имеет большой потенциал для лечения дефектов длинных сегментов кости.
4. Заключение и перспективы
Сосудистые эндотелиальные прогениторные клетки имеют очень перспективное применение в области тканевой инженерии, но исследования только начались, и еще предстоит решить множество вопросов, таких как поверхностные маркеры и оптимальные системы культивирования. Предполагается, что будущие исследования приведут к прорыву в изучении их сосудистого фенотипа, роли в ремоделировании тканей и биологических свойств, а также в применении этих клеток для повышения эффективности терапии и снижения побочных эффектов. Будучи одним из представителей посевных клеток тканевой инженерии, EPC показали большой потенциал для клинического применения в регенеративной медицине с появлением концепций аутологичной клеточной терапии и генной модификации.