Опухоли глиального происхождения являются наиболее распространенными опухолями центральной нервной системы и также трудно поддаются лечению у людей. Глиобластома (GBM) является наиболее представительной из этих опухолей и также называется мультиформной глиобластомой из-за разнообразия и неоднородности гистоморфологии между опухолями и внутри них. В последние два десятилетия гетерогенность ГБМ стала пониматься не только с точки зрения ее гистологических проявлений, но и с точки зрения ее гетерогенного биологического поведения (пролиферация и апоптоз, ангиогенез и инвазивная миграция) и, соответственно, гетерогенного терапевтического ответа [1,2]. На протяжении 1990-х годов гетерогенность ГБМ объяснялась только генетическими фенотипическими изменениями в опухолевых клетках. Открытие стволовых клеток опухолей головного мозга стало важным событием в исследованиях в области нейроонкологии и оказало глубокое влияние на наши научные исследования, касающиеся способа развития ГБМ, гетерогенности опухоли, взаимоотношений между опухолевыми клетками и микроокружением, а также терапевтических стратегий [1-3].
I. Выявление и скрининг стволовых клеток опухолей головного мозга
Только около 0,01-1% опухолевых клеток при остром миелоидном лейкозе могут быть индуцированы экспериментальной трансплантацией, что является первым доказательством существования опухолевых стволовых клеток [2]. Впоследствии опухолевые стволовые клетки были также обнаружены в солидных опухолях, таких как молочная железа, толстая кишка, поджелудочная железа и легкие [4]. Опухолевые стволовые клетки также были обнаружены в первичных опухолях мозга высокой степени злокачественности, таких как глиомы, медуллобластомы, вентрикулярные менингиомы и нейробластомы; в опухолях мозга низкой степени злокачественности положительных результатов пока не получено [5]. Стволовые клетки опухолей мозга обладают сходными с нейральными стволовыми клетками характеристиками, такими как способность к самообновлению, образованию клеточных клубков в бессывороточной среде, экспрессия маркеров стволовых клеток и многоспектральный потенциал дифференцировки; стволовые клетки опухолей мозга отличаются от нейральных стволовых клеток тем, что экспрессируют аномальные маркеры дифференцировки, имеют хромосомные аномалии и обладают опухолеобразующей способностью [5]. Если и есть что-то, что необходимо установить и стандартизировать в области исследования стволовых клеток опухоли мозга, так это идентификация и скрининг стволовых клеток опухоли мозга, что касается всей теоретической системы стволовых клеток опухоли мозга. На самом деле, результаты исследований стволовых клеток опухолей головного мозга непоследовательны или даже противоречивы, и одной из основных причин этого являются различные методы и процедуры выделения и обогащения субпопуляций опухолевых клеток.
Наиболее часто используемыми молекулярными маркерами клеточной поверхности при ГБМ являются CD133, A2B5, CD5, CD171, ITGA6 и EGFR [3]. CD133, A2B5 и CD15 являются суррогатными маркерами, для которых не найдена четкая биологическая функция, в то время как CD171, ITGA6 и EGFR являются функциональными маркерами [3]. Иммуномагнитная сортировка бусин и флуоресцентно-активационная сортировка клеток (FACS) используют эти молекулярные маркеры для выделения опухолевых стволовых клеток.
Мы используем CD133 в качестве примера, иллюстрирующего влияние методологии, использующей суррогатные маркеры опухолевых стволовых клеток, на интерпретацию результатов исследования. CD133 был впервые использован для выделения гемопоэтических и нейрональных стволовых клеток, а также широко применяется для идентификации и сортировки стволовых клеток опухолей мозга [6,7]. При ГБМ CD133+ клетки выращивались внутричерепно у мышей NOD-SCID, обладая опухолеродной способностью по сравнению с CD133-клетками [3]. Однако сообщалось и о других результатах, когда CD133-клетки, выделенные из образцов тканей ГБМ или культивированных in vitro клеточных линий, также обладали опухолеобразующей способностью [8,9]. Этот противоречивый результат может быть вызван методологическими недостатками. Во-первых, в отличие от метода FACS, метод сортировки иммуномагнитными бусинами не обладает специфичностью, и полученные CD133+ клетки смешиваются с CD33-клетками, которые не связаны специфически с иммуномагнитными бусинами, и не обогащаются только CD133+ клетками [10]. Аналогично, вывод о том, что «CD133-клетки являются опухолеобразующими», также может быть обусловлен смешиванием CD133-клеток с CD133+ клетками во время сортировки [11]. Конечно, стандартизированные методы очистки клеток и строго разработанные эксперименты по внутреннему контролю могут помочь исключить влияние клеток. Кроме того, эндотелиальные клетки в строме глиомы экспрессируют CD133, CD133+ клетки, выделенные из опухолевой ткани, будут содержать CD133+ эндотелиальные клетки, а CD133+ клетки будут иметь преимущество в росте перед CD133-клетками в модели трансплантации. Однако в недавнем исследовании сообщалось, что как FACS-очищенные CD133+ клетки, так и CD133- клетки обладают способностью стимулировать рост опухоли у мышей nude, даже если исключить влияние эндотелиальных клеток [11]. Типы анти-CD133 антител, используемых для сортировки опухолевых стволовых клеток, включают анти-CD133/1 и анти-CD133/2 антитела, которые распознают два различных гликозилированных эпитопа трансмембранного белка CD133, что также влияет на согласованность результатов между исследованиями [12]. Несоответствие экспериментальных результатов из-за методологических недостатков присутствует и для суррогатных молекулярных маркеров, таких как A2B5 и CD15 [3].
Открытие и оптимизация функциональных маркеров, которые могут служить как маркерами обогащения опухолевых стволовых клеток, так и терапевтическими мишенями, является важным направлением исследований. Далее мы проиллюстрируем это на примере рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), маркера нейральных стволовых клеток [13], который играет важную роль в регуляции деления и поддержания стволовости нейральных стволовых клеток в субвентрикулярной зоне [14,15]. Молекулярная невропатология давно установила, что EGFR экспрессируется в более чем 60% первичных ГБМ, но не во вторичных ГБМ, что имеет диагностическое и прогностическое значение. Распределение EGFR+ опухолевых клеток в одном и том же образце опухоли GBM неоднородно, что позволяет предположить, что EGFR может быть использован в качестве молекулярного маркера для различения субпопуляций клеток в GBM [16]. Субпопуляции клеток GBM были выделены методом FACS из образцов тканей GBM человека и линий опухолевых стволовых клеток, в которых субпопуляции EGFR+ клеток демонстрировали наиболее злокачественные молекулярные и функциональные фенотипы независимо от того, коэкспрессировали ли они CD133 и CD15 [3]. Изменение экспрессии EGFR в клетках линий опухолевых стволовых клеток путем усиления или ослабления функции приводит к соответствующему стимулированию или ингибированию роста клеток. Очевидно, что экспрессия EGFR необходима для формирования глиомы и может быть использована не только как функциональный маркер субпопуляций клеток глиомы, но и как терапевтическая мишень для ГБМ. Также было обнаружено, что субпопуляции EGFR-опухолевых клеток могут демонстрировать реэкспрессию EGFR во время формирования пересаженной опухоли, что говорит о том, что регуляция экспрессии маркеров стволовых клеток является динамическим процессом. Более новые исследования также показали, что динамическое поддержание субпопуляций опухолевых клеток существует в меланоме и ГБМ [17,18].
II. Теория опухолевого генеза при глиоме
Сложный клеточный состав опухоли динамически изменяется, с постоянной потребностью в пополнении клеток при пролиферации, инвазии и специализации опухолевых клеток, и существует два механизма объяснения неоднородности опухоли, вызванной этим процессом, а именно: иерархическая модель и стохастическая модель.
Иерархическая модель относится к тому факту, что для возникновения и поддержания опухоли требуется небольшая субпопуляция «стволовых» клеток, т.е. опухолевых стволовых клеток. Опухолевые стволовые клетки пролиферируют неограниченно и дифференцируются без разбора из-за неконтролируемого самообновления; большинство опухолевых клеток, которые дифференцируются из опухолевых стволовых клеток, не обладают способностью к самообновлению и не оказывают существенного влияния на иммортализацию опухоли. Гетерогенность опухоли обусловлена сосуществованием опухолевых стволовых клеток и их дифференцированных потомков. Стохастическая модель — это модель, в которой большинство клеток в опухоли обладают способностью к самообновлению, способствуя как опухолевому генезу, так и поддержанию опухоли. Гетерогенность опухолей в основном обусловлена молекулярно-генетическими и эпигенетическими различиями между клонами опухолевых клеток. Более того, стохастическая модель предполагает, что все опухолевые клетки внутри опухоли обладают способностью к образованию опухоли, хотя в определенной степени процесс образования опухоли также требует совместной работы команды клеток для ее поддержания; различия в фенотипе клеток, пополняющихся внутри опухоли, отражают клоны клеток, присутствующих на разных стадиях трансформации опухоли и злокачественности [19,20].
Первоначально несколько исследований показали, что в злокачественных гематопоэтических опухолях, раке молочной железы и толстой кишки лишь небольшая субпопуляция опухолевых клеток обладает способностью образовывать новые опухоли, что является сильной поддержкой иерархической модели [21]. Однако последующие исследования поставили под вопрос, подходит ли иерархическая модель для всех типов опухолей. Келли и др. 2007 обнаружили, что более 10% клеток, выделенных из трех различных мышиных моделей первичных опухолей кроветворной системы, обладают способностью индуцировать опухоли у необлученных мышей-реципиентов [22]. Шмельков и др. 2008 сообщили, что при раке толстой кишки у мышей CD133-клетки также обладают опухолевыми свойствами. опухолеобразующую способность в раке толстой кишки у мышей [23]. В соответствии с этим, анализ пересадки одноклеточных клеток показал, что количество клеток, инициирующих опухоль, в человеческой меланоме составляет более 25%. Недавно были получены аналогичные сообщения о глиобластоме. Действительно, модель класса может быть более подходящей для гемопоэтических опухолей и некоторых солидных опухолей, таких как рак молочной железы, толстой кишки и поджелудочной железы, а также медуллобластома, которые имеют строгий и четко определенный класс клеток в ткани происхождения [11,18]. В отличие от этого, ГБМ имеет ткани происхождения с мезенхимально-подобной архитектурой, такие как нервный гребень и зрелый мозг, что может потребовать случайного паттерна и очень гибкой схемы опухолегенеза. В ГБМ существует несколько групп активных инициирующих опухоль клеток, каждая из которых может отличаться специфической экспрессией маркерных белков и различными функциональными фенотипами или молекулярными характеристиками генов (инвазивные, проангиогенные или пролиферативные). Случайная модель опухолевого генеза может быть более подходящей, чем иерархическая, для объяснения присущей ГБМ гетерогенности, но нельзя считать, что иерархическая модель должна быть полностью исключена. Недавно в исследованиях лейкемии было высказано предположение, что иерархическая и случайная модели не являются взаимоисключающими и что эволюция опухолевых клеток будет регулироваться обеими моделями [11].
III. Микроокружение стволовых клеток глиомы
Если понимать опухоль как микроэкосистему, то существует взаимосвязь не только между различными клеточными клонами, но и между опухолевыми клетками и микроокружением. В этой синергетической системе клоны опухолевых клеток конкурируют друг с другом за кислород, питательные вещества и пространство, и более сильные побеждают в результате естественного отбора; система создает локальную микросреду между опухолевыми и неопухолевыми клетками, способствующую росту опухоли, инвазии, апоптозу и/или устойчивости к лечению и уклонению от иммунитета. Компоненты микроокружения в опухолях мозга включают микроглию, макрофаги, астроциты, олигодендроциты, нейроны, глиальные и нейрональные предшественники, внеклеточный матрикс, перициты и эндотелиальные клетки [1]. Клетки ГБМ легко инвазируют вдоль миелиновых аксонов, сосудистых мембран или субвентрикулярных мембран, иллюстрируя влияние микроокружения на инвазивную миграцию опухолевых клеток [24]. Взаимодействие между клетками глиомы и эндотелиальными клетками в микроокружении важно для поддержания «стволовости» опухолевых стволовых клеток [25]. В моделях ксенотрансплантатов пролиферация эндотелиальных клеток или сосудов может расширить популяцию самообновляющихся клеток и ускорить рост опухоли. Напротив, целенаправленное ингибирование EGFR, снижение регуляции VEGF с помощью эрлотиниба или прямая нейтрализация VEGF бевацизумабом могут уменьшить рост опухоли и снизить количество клеток, способных к самообновлению.
Поддержание и выживание опухолевых стволовых клеток регулируется как внутренне, через пути пролиферации и выживания, включая c-Myc, Oct4 (POU5F1), Olig2 и Bmi1 [26], так и внешне, через факторы роста и взаимодействие с клеточным матриксом, которые происходят в микроокружении или нишах, в которых находится опухоль. Исследования показали, что взаимосвязь между опухолевыми стволовыми клетками и микроокружением, в котором они находятся, может влиять на судьбу клеток в ГБМ [27,28]. Однако взаимодействие между опухолевыми клетками и микроокружением еще далеко не изучено. В быстрорастущих глиомах остается неясным, создают ли опухолевые клетки свою собственную микросреду, или же микросреда уже существует для привлечения опухолевых стволовых клеток? Какова двусторонняя связь между опухолевыми клетками и стромой? Какова роль опухолевых стволовых клеток на переднем крае инвазии опухоли и как они взаимодействуют с иммунной системой? Углубленное изучение механизмов связи между опухолевыми стволовыми клетками и микроокружением будет полезно для определения устойчивости опухолевых стволовых клеток к опухолевому генезу, росту, поддержанию, инвазии и лечению, а также приведет к разработке более эффективных терапевтических стратегий для злокачественных глиом.
Иммунодефицитные мыши обычно используются для исследований опухолевых стволовых клеток in vivo, но иммунодефицитные мыши не способны воспроизводить компоненты иммунной системы, которые присутствуют у пациентов с опухолями и являются важными факторами формирования клеточных классов [5]. Иммунодефицитное состояние может позволить расти определенным опухолевым клеткам, а также исказить реальное положение дел у пациента. Генетически модифицированные мышиные модели могут производить гомозиготных хозяев, но относительное отсутствие клеточной гетерогенности и дифференциальная сигнализация факторов между различными видами клеток остается проблемой для исследований опухолевых стволовых клеток. Следует отметить, что не существует модельной системы, которая могла бы полностью представить широкое разнообразие молекулярно-генетических и эпигенетических изменений в условиях человека и достоверно отразить особенности взаимодействия между опухолевыми стволовыми клетками и микроокружением, в котором они находятся.
IV. Последствия для терапии
Молекулярно-направленная терапия менее токсична и более эффективна, чем традиционные цитотоксические препараты, и может дополнить существующие терапевтические подходы, однако результаты испытаний первого поколения направленной терапии при злокачественных глиомах неутешительны. Действительно, одноагентное лечение таргетными препаратами не принесло успеха при рецидивирующих злокачественных глиомах. Очевидно, что гетерогенность субпопуляций пролиферирующих клеток опухоли является одной из основных причин клинического ответа на терапию [11,18]. Например, использование малых молекулярных ингибиторов тирозинкиназы (TK) для ингибирования киназного домена EGFR могло бы стать терапевтической стратегией для ГБМ, но лишь несколько клинических исследований, о которых сообщалось на сегодняшний день, показали, что ингибиторы EGFR сами по себе лишь частично эффективны при ГБМ [29]. и совместной активации нескольких TK в одних и тех же опухолевых клетках [30,31]. Фактически, высокозлокачественные EGFR+ клетки GBM отвечают на ингибиторы ТК, и выбор EGFR в качестве терапевтической мишени является обоснованным, за исключением случаев сосуществования EGFR+ клеток и EGFR- клеток в одной опухоли, а также отсутствия реакции EGFR- клеток на лечение, что приводит к рецидиву опухоли [11]. Ожидается, что разработка стратегии комбинированного ингибирования, направленного на несколько молекул и клеток одновременно, позволит преодолеть устойчивость некоторых клеточных субпопуляций GBM к лечению [3].
В связи с гетерогенной природой злокачественных глиом дальнейшие терапевтические стратегии должны учитывать следующее.
(1) Продолжение поиска молекулярных маркеров, способных селективно идентифицировать различные субпопуляции клеток ГБМ, особенно функциональные, не только как потенциальные терапевтические мишени, но и для прогнозирования ответа на лечение и прогноза [32].
(2) Объединение генотипов и генеза клеточных линий для типирования злокачественных глиом с помощью геномного и транскрипционного профилирования объемных клинических образцов опухоли может не только облегчить понимание функциональных различий между различными субпопуляциями клеток опухоли, но и выявить новые мишени для терапии [33].
(3) Выявление субпопуляций опухолевых клеток в ГБМ с минимальной генетической маркировкой позволяет проспективно прогнозировать, получат ли пациенты пользу от конкретных целевых терапий, что дает возможность индивидуализировать и оптимизировать лечение ГБМ [13,34-36].
(4) Эффективная стратегия лечения ГБМ должна учитывать всех участников «стадии» ГБМ, принимая во внимание, что гетерогенность ГБМ следует рассматривать как динамический процесс и что субпопуляции клеток ГБМ со специфическими молекулярными маркерами также имеют временной период или период окна и должны лечиться в соответствии со сбалансированной стратегией лечения и временной последовательностью [3]. терапевтические средства [3].