Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), в основе которых лежат атеросклероз и микроангиопатия, являются основным осложнением диабета и ведущей причиной инвалидности и смерти при диабете. Повреждение и дисфункция эндотелиальных клеток (ЭК) являются инициирующими факторами в развитии и прогрессировании диабетических сосудистых осложнений. Поэтому изучение механизмов повреждения эндотелия и поиск эффективных способов восстановления структуры и функции поврежденного эндотелия стало актуальной темой исследований.
Эндотелиальные прогениторные клетки (EPCs) — это клетки, полученные из костного мозга, которые могут расширяться и далее дифференцироваться в ECs in vitro и участвовать в восстановлении и реваскуляризации поврежденного эндотелия. Эндотелиальная синтаза оксида азота (eNOS) необходима для миграционной способности EPCs.
Окислительный стресс может быть спровоцирован высоким уровнем глюкозы в организме, что в свою очередь может привести к нарушению функции EPCs и снижению выработки оксида азота (NO), а вмешательство с использованием супероксиддисмутазы (SOD) может привести к увеличению секреции NO и восстановлению функции. Антиоксидантные ферменты включают супероксиддисмутазу (SOD), каталазу (CAT) и глутатионпероксидазу (GSH-Px), а неферментативные антиоксидантные системы включают витамин С, витамин Е, глутатион, мелатонин, альфа-липоевую кислоту (ALA), каротиноиды и микроэлементы, такие как медь, цинк и селен (Se).
В этом исследовании ЭПК инкубировали с высокими концентрациями глюкозы, чтобы вызвать окислительный стресс, и измеряли уровни малонового диальдегида (МДА) и оксида азота (NO) в культуральных супернатантах. Экспрессию мРНК GPx-1 и eNOS наблюдали с помощью количественной флуоресцентной РТПЦР в реальном времени, а экспрессию белка GPx-1 и eNOS определяли с помощью вестерн-блота, после чего применяли антиоксидант ALA. Затем с помощью антиоксиданта ALA было проведено исследование механизма индуцированного глюкозой повреждения EPCs и терапевтических мер, чтобы создать основу для профилактики и лечения диабетических сосудистых осложнений.
1. материалы и методы
1.1 Материалы
1.1.1 Экспериментальные животные: 15 чистопородных здоровых самцов крыс Вистар (весом 180-200 г), предоставленных Центром экспериментальных животных Хэбэйского медицинского университета, сертификат на животных № 902035.
1.1.2 Реактивы Набор для анализа МДА и NO (Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering), 50% инъекция глюкозы (Huarui Pharmaceutical Co., Ltd.), среда EGM-2MV (LONZA, США), изолят лимфоцитов крысы (Tianjin Hao Yang Co., Ltd.);
Фибронектин человека (Solabank Technology Co., Ltd.), трипсин (sigma, США), реактив для выделения РНК Trizol Reagent (Invitrogen, США), обратная транскриптаза (M-MLV ), случайные праймеры производства Promega, кроличье античеловеческое поликлональное антитело GPx-1 (ABCAM, Великобритания), кроличье античеловеческое поликлональное антитело GPx-1, кроличье античеловеческое поликлональное антитело GPx-1 (ABCAM, Великобритания). Антитело к eNOS (Santa, США), ALA (Eisai Pharmaceutical Co., Ltd., Япония).
1.1.3 Экспериментальные инструменты УФ-спектрофотометр (756MC) (Shanghai Precision Instrument Science Co.
), флуоресцентная система количественной ПЦР в реальном времени ABI 7300 (PE, США), система сканирования гелей UVP (UVP, США), прибор для двойного электрофореза в постоянном времени DYZ22A и прибор для мостового электрофореза DYY-III (Beijing Liuyi Instrument Factory), инвертированный микроскоп (Olympus, Япония), ультрачистый столик (HFsafe1200) (Likang Development Co., Ltd.), углекислый газ. инкубатор (MCO-15AC) (Heraeus, Германия), планшеты для клеточных культур и культуральные флаконы (Corning, США)
1.2 Экспериментальные методы
1.2.1 Культура ЭПК костного мозга крысы
Нижняя конечность крысы была удалена хирургическими ножницами, кожа нижней конечности была срезана, нижняя конечность была замочена в 75% спирте на 30 мин, бедренная кость была отделена от большеберцовой кости вдоль коленного сустава в ультрачистом столе, мышцы нижней конечности были удалены, кость нижней конечности была обнажена в асептических условиях, погружена в культуральную посуду, содержащую PBS, кость нижней конечности была отрезана с обоих концов, и полость костного мозга была многократно промыта PBS в ультрачистом столе;
Затем промывочный раствор медленно накладывали на изолят лимфоцитов крысы и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 мин. После центрифугирования жидкость в пробирке разделяли на три слоя, средний белый мутный слой аспирировали, добавляли 4-кратный объем PBS и перемешивали, супернатант отбрасывали и центрифугировали в течение 10 мин, затем промывку повторяли один раз. После окончательного центрифугирования отбросьте супернатант и добавьте EGM-2MV для ресуспендирования клеток.
Fn вносили в луночные планшеты при плотности 5ug/cm2 , а суспензию клеток инокулировали в шестилуночные и 24-луночные планшеты при плотности 2×106 клеток/мл. Первый полный объем жидкости меняли через 48 часов, затем ежедневно и каждые два дня через 7 дней. Рост клеток наблюдался ежедневно под инвертированным микроскопом.
1.2.2 Идентификация 2ЭПК
Морфологическая идентификация: ежедневно наблюдайте за морфологией и ростом клеток под инвертированным микроскопом.
Поглощение EPCs DIL-Ac-LDL в сочетании с FITC-Lectin-UEA-1: Клетки на 10 день культуры добавляли в среду, содержащую DIL-Ac-LDL (2.5ug/mL), инкубировали в течение 4 часов, промывали 3 раза PBS, фиксировали в 2% параформальдегиде в течение 20 минут, затем добавляли FITC-Lectin-UEA-1 ( 10ug/mL), инкубировали в течение 1 часа, наблюдали под лазерным конфокальным микроскопом, клетки, дважды окрашенные в оранжево-желтый цвет, были EPC, и дважды окрашенные клетки подсчитывали.
1.2.3 Экспериментальная группировка
ЭПК переваривали с 0,25% трипсином/0,02% ЭДТА в течение 4 дней и группировали в течение 24 ч.
ЭПК инкубировали в течение 48 ч с глюкозой 5 ммоль/л в качестве нормального контроля (НК), глюкозой 30 ммоль/л в качестве высокого уровня глюкозы (ВУГ) и глюкозой (30 ммоль/л) + α-липоевая кислота (40 мкг/л) в качестве группы ALA.
1.2.4 NO и МДА измеряли химическим колориметрическим методом, методом Вестерн-блот для определения экспрессии GPx-1 и eNOS в ЭПК, методом количественной флуоресцентной RT-PCR в реальном времени для измерения экспрессии мРНК GPx-1 в ЭПК.
1.3 Статистические методы
Все данные были проанализированы с помощью пакета статистического анализа SPSS 13.0. Все данные измерений были выражены как среднее ± стандартное отклонение (±s). Сравнение средних значений по нескольким выборкам проводилось с помощью одностороннего ANOVA с полностью рандомизированным дизайном, а значимые различия считались при P<0,05. 2. Результаты 2.1 Влияние различных вмешательств на выделение МДА ЭПК (Таблица 3) Уровень МДА в супернатанте культуры был выше, чем в нормальной контрольной группе после 48 ч вмешательства высокой глюкозы (P<0,05); уровень МДА снизился после применения вмешательства ALA по сравнению с группой высокой глюкозы (P<0,05). 2.2 Влияние различных вмешательств на экспрессию GPx-1 и eNOS в ЭПК (рис. 1-4, табл. 1) Экспрессия GPx-1 и eNOS в ЭПК была значительно ниже, чем в контрольной группе через 48 часов после вмешательства с высоким содержанием глюкозы, в то время как экспрессия GPx-1 и eNOS в ЭПК значительно увеличилась после вмешательства ALA по сравнению с группой с высоким содержанием глюкозы (оба P<0,05). 2.3 Влияние различных вмешательств на экспрессию мРНК GPx-1 и eNOS в ЭПК (рис. 5-8, табл. 2) Уровни экспрессии мРНК GPx-1 и eNOS в ЭПК были значительно ниже, чем в контрольной группе после 48 часов вмешательства с высоким содержанием глюкозы, в то время как экспрессия мРНК GPx-1 и eNOS в ЭПК значительно увеличилась после вмешательства ALA по сравнению с группой с высоким содержанием глюкозы (оба P<0,05). 2.4 Влияние различных вмешательств на уровень секретируемого NO в ЭПК (рис. 9, табл. 3) Через 48 часов после вмешательства высокого сахара ЭПК секретировали более низкие уровни NO по сравнению с группой нормального контроля (P < 0,05), в то время как после вмешательства ALA экспрессия eNOS в ЭПК значительно увеличилась по сравнению с группой высокого сахара (P < 0,05), а уровни NO в культуральном супернатанте были повышены. 3. Обсуждение В 2004 году на ежегодном собрании Американской диабетической ассоциации (ADA) Браунли, лауреат премии Бантинга, выступил с лекцией: и макрососудистые, и микрососудистые осложнения вызваны одним и тем же патогенезом - окислительным стрессом, который является общей основой повреждения при высоком уровне глюкозы; в том же году в Европейской ассоциации по изучению диабета (EADS) была прочитана лекция о важности одного и того же патогенеза - окислительного стресса. В том же году Цериелло, получивший главный приз на ежегодном собрании Европейской ассоциации по изучению диабета (EASD), выступил с лекцией об окислительном стрессе как общем механизме инсулинорезистентности, диабета и сердечно-сосудистых заболеваний - теории общей почвы. EPCs - это клетки-предшественники, присутствующие в циркулирующей периферической крови, которые могут дифференцироваться в сосудистые эндотелиальные клетки (ECs) и получаемые из костного мозга, пуповинной крови или фетальной печени. В случае повреждения сосудов или ишемии тканей, EPC, присутствующие в костном мозге, могут пролиферировать в ответ на местно выделяемые факторы роста и цитокины, дифференцироваться в зрелые эндотелиальные клетки и мобилизоваться в периферическую циркуляцию, где они специфически гнездятся в месте повреждения или ишемии для дальнейшей пролиферации и дифференцировки в зрелые эндотелиальные клетки, участвуя в неогенезе и реэндотелизации сосудов. Когда количество и функция EPCs нарушаются, баланс между повреждением и восстановлением эндотелия нарушается, и целостность эндотелия нарушается, что приводит к атероматозным поражениям. Поэтому эндотелиальные прогениторные клетки играют важную роль в регулировании баланса апоптоза/регенерации и поддержании целостности эндотелиального слоя. Поэтому функция EPCs тесно связана с развитием и прогрессированием диабетических сосудистых осложнений и является предиктором сердечно-сосудистых заболеваний. Dernbach et al[6] исследовали окислительную чувствительность здоровых взрослых ЭПК и обнаружили, что здоровые взрослые ЭПК имели более низкий внутриклеточный уровень ROS и более низкий оксидант-опосредованный апоптоз, чем эндотелиальные клетки пупочной вены, а экспрессия антиоксидантов, таких как супероксиддисмутаза марганца (MnSOD), GSH-Px и CAT, была увеличена на поверхности ЭПК по сравнению с эндотелиальными клетками пупочной вены. EPC обладают более сильной антиоксидантной способностью, чем эндотелиальные клетки; Это способствует их жизнеспособности, но недостаточно для противодействия влиянию факторов риска на эндогенную антиоксидантную систему ЭПК, которая при высоких уровнях окислительного стресса нарушает окислительно-восстановительное состояние внутри ЭПК, что приводит к апоптозу и сенесценции, нарушающим их функцию. Повышенный уровень глюкозы в крови может активировать внутриклеточный NADPH через путь PKC, генерируя большое количество реактивных форм кислорода (ROS) и повреждая клетки, вызывая снижение нормальной клеточной биологической активности, нарушение энергетического обмена, клеточной сигнализации и других функций, что означает, что окислительный стресс может быть индуцирован высоким уровнем глюкозы. Также было показано, что высокая глюкоза может влиять на мобилизацию костного мозга и выживание EPCs через окислительный стресс и путь P38MAPK. У пациентов с диабетом и у обработанных глюкозой ЭПК снижалась биодоступность NO или уменьшалось количество тетрагидробиоптерина (BH4), кофактора eNOS, что приводило к отсоединению eNOS, генерированию супероксидных отрицательных ионов (O-) и к накоплению кластеров реактивных видов кислорода (ROS), дальнейшему снижению количества и миграционной способности ЭПК. Окислительный стресс в клетках, опосредованный оксидом ЛПНП, играет ключевую роль в патогенезе атеросклероза. Окс-ЛПНП влияет на функцию EPCs, способствуя их старению через ингибирующее действие на EPCs eNOS. Недавние исследования показали, что окс-ЛПНП у пациентов с диабетом приводит к дисфункции EPCs через P53-опосредованные сигнальные пути, в отличие от ЛПВП, который считается защитным фактором для сосудистой функции благодаря своим антиоксидантным и противовоспалительным свойствам. В данном исследовании мы инкубировали полученные из костного мозга крысы ЭПК с высоким содержанием глюкозы в течение 48 часов и показали значительное увеличение уровня МДА в культуральных супернатантах, что свидетельствует о том, что высокий уровень глюкозы может привести к окислительному стрессу в ЭПК. Это может привести к апоптозу и окислительному повреждению ДНК. GPx-1 - ключевой окислительно-восстановительный белок, играющий важную роль в защите эндотелия от окислительного стресса и, таким образом, в поддержании стабильной сосудистой среды. Исследования показали, что активность GPx-1 снижена в бляшках изолированных сонных артерий. Также было показано, что сверхэкспрессия GPx-1 поддерживает нормальную функцию эндотелия сосудов в эндотелиальных клетках, культивируемых с высокой концентрацией цистеина. Более того, было также показано, что недостаток GPx-1 приводит не только к дисфункции эндотелия сосудов, но и к структурным аномалиям сердца и сосудов. Кроме того, Ac-LDL+ Lectin+ VEGFR-2+ eNOS+ клетки, выделенные из нокаутных мышей с GPx-1, функционально неспособны продвигать ангиогенез и обладают повышенной чувствительностью к окислительному стрессу как in vivo, так и in vitro [21]. антиоксидантных ферментов, что приводит к старению и дисфункции EPCs in vivo, в дальнейшем приводя к усилению апоптоза. eNOS является цитохром P450 редуктазоподобным ферментом, катализирующим опосредованный флавином перенос электронов от донора электронов NADPH к субтилизиновому кофактору. Кофактор eNOS BH4 находится рядом с субтилизиновой группой и может переносить электроны на гуанидиниевый азот L аргинина для производства NO. В отсутствие L аргинина или BH4, eNOS производит O2- и H2O2, явление, известное как Это явление известно как отсоединение eNOS. Это явление известно как отсоединение eNOS. eNOS играет важную роль в мобилизации и функциональной регуляции EPCs. Отсоединение eNOS вызывает повышение уровня ROS, что приводит к нарушению функции EPCs. У пациентов с диабетом отсоединение eNOS уменьшает количество EPC, снижая их функцию и в конечном итоге приводя к развитию сосудистых заболеваний. Было показано, что eNOS является важным веществом для обеспечения миграционной способности EPCs. Нокаут eNOS у мышей может привести к снижению миграционной способности EPCs [25], и обеспечение адекватной экспрессии eNOS, нормальной секреции NO и нормальной биологической активности является важным фактором для поддержания нормальной биологической функции EPCs. В этом исследовании мы применили высокую концентрацию глюкозы для воздействия на EPCs в течение 48 часов и обнаружили, что Уровень экспрессии белка GPx-1 и экспрессии мРНК в EPCs снизился, в то время как наблюдалось снижение экспрессии мРНК белка eNOS и даун-регуляция и секреция NO; Таким образом, результаты данного исследования позволяют предположить, что высокая глюкоза может вызвать окислительный стресс в EPCs в дополнение к снижению экспрессии антиоксидантных ферментов, тем самым ухудшая их антиоксидантный потенциал и влияя на их функцию. ALA - это природный антиоксидант, способный уничтожать различные свободные радикалы, образующиеся в ходе физиологических и патологических процессов, и уменьшать окислительный стресс в организме. Исследования показали, что ALA может улучшать функцию эндотелия сосудов у крыс путем повышения активности NO, снижения продукции ROS [26] и ингибирования экспрессии NF-κB, а также может снижать уровень окислительного стресса in vivo путем активации пути AMPK в эндотелиальных клетках и обратного воздействия на гиперполяризацию мембран митохондрий, вызванную высоким содержанием глюкозы. В данном исследовании, в результате воздействия ALA на ЭПК, инкубированные с высоким содержанием глюкозы, было обнаружено, что экспрессия GPx-1 и eNOS была повышена в ЭПК, секреция NO была увеличена, а секреция MDA была снижена в ЭПК, что указывает на то, что лечение ALA может уменьшить окислительный стресс, вызванный ЭПК под воздействием высокого содержания глюкозы, и восстановить их антиоксидантную способность, тем самым защищая их функции. В заключение следует отметить, что высокая концентрация глюкозы может вызывать окислительный стресс в ЭПК, с одной стороны, и снижать продукцию и экспрессию их антиоксидантных ферментов и ухудшать их антиоксидантную способность, с другой стороны, а лечение антиоксидантного стресса может улучшить антиоксидантную способность и способность секреции NO ЭПК. Это позволяет предположить, что лечение антиокислительного стресса имеет значение для профилактики и лечения возникновения и развития диабетических сосудистых осложнений.