Восстановление стабильности позвоночника после лечения врожденных деформаций позвоночника, дегенерации, приобретенной нестабильности и опухолей позвоночника требует костной пластики для облегчения сращения позвоночника. Клиническая статистика в США показывает, что большинство из более чем 250 000 операций по сращению позвоночника, выполняемых каждый год, требуют костной пластики для облегчения сращения позвоночника, и хотя точных статистических данных по Китаю нет, фактическая ситуация может превышать таковую в США в процентном соотношении. Хотя аутологичная костная пластика остается золотым стандартом для обеспечения сращения позвоночника, остеосинтез по-прежнему происходит у 5-35% пациентов с односегментным сращением позвоночника, а частота остеосинтеза еще выше при многосегментном сращении позвоночника. Кроме того, до сих пор существует множество трудноразрешимых проблем с аутологичными костными, аллогенными костными и биозамещающими трансплантатами. Поэтому существует острая необходимость в дальнейшем изучении биологических механизмов регенерации кости, чтобы найти лучшие способы содействия сращению позвоночника. Применение локальной генной терапии, которая высвобождает остеогенные передатчики в определенных анатомических областях позвоночника для стимуляции образования новой кости и, таким образом, максимального сращения позвоночника, является многообещающей альтернативой традиционной аутологичной костной пластике. В этой статье мы рассмотрим последние достижения в генной терапии для сращения позвоночника. 1. Перспективы генной терапии при сращении позвоночника Сращение позвоночника отличается от заживления костей при переломах длинных костей конечностей: 1) это не реконструкция исходной анатомической структуры, а скорее реконструкция разумной механической структуры позвоночника для изменения анатомических изменений при патологии позвоночника вследствие сколиоза, соскальзывания, опухоли, инфекции и травмы. 2) заднебоковое межпоперечное сращение позвоночника имеет уникальную местную микросреду: поперечные отростки маленькие и де-кортикализованные, что очень чувствительно к кровотоку трансплантата. Кровоснабжение трансплантата после кортикализации невелико, особенно в центральной части трансплантата, что требует реваскуляризации; межпоперечное сращение представляет собой большой сегмент эктопического остеогенеза между паравертебральными мышцами, а механизм сращения и механическая среда, которой оно подвергается, отличаются от ортотопической репарации костных трансплантатов конечностей. В последние годы методы инженерии костной ткани с участием наук о жизни и инженерии стали важным направлением исследований в области восстановления и реконструкции костей. В клинических экспериментальных исследованиях по сращению позвоночника для эффективного сращения позвоночника необходимо имплантировать до миллиграммов рекомбинантных человеческих костных морфогенетических белков (rhBMPs) между задними поперечными отростками, чтобы преодолеть недостатки, связанные с легкой потерей, коротким периодом полураспада и низкой эффективностью применения экзогенного белка. Однако дальнейшее клиническое применение супрафизиологических доз rhBMPs затруднено из-за высокой стоимости и неопределенности долгосрочных физиологических эффектов. В настоящее время, в условиях, когда исследовательские стратегии генной терапии были переориентированы на лечение несмертельных заболеваний, генная терапия имеет наибольшие шансы на успех в клиническом восстановлении тканей (например, заживлении костей) в области ортопедии с использованием существующих технологий. В случае сложных клинических ситуаций генная терапия подходит для лечения сращений позвоночника: (1) процесс заживления костей является высоко консервативным и хорошо изученным, а эффективность BMP как эффективного остеогенного гена хорошо установлена. (2) В отличие от лечения хронических заболеваний, заживление костей обычно завершается в течение нескольких недель, и этот процесс не требует длительной и эффективной экспрессии экзогенных генов. Выбрав конкретный вектор для введения генов, можно контролировать экспрессию терапевтического гена, избегая тем самым чрезмерного производства новой кости, которое может повлиять на функции организма. (3) Подход локальной генной терапии позволяет выбрать конкретные затравочные клетки и ввести терапевтический ген в конкретные анатомические области перелома конечности или позвоночника через эти генетически модифицированные клетки, что позволяет избежать осложнений при системном применении и сделать технические требования относительно простыми. (4) Результаты предварительных экспериментов на животных являются относительно удовлетворительными. 2. Стратегии и методы генной терапии для сращения позвоночника 2.1 Опосредованная аденовирусом генная терапия с BMPs для сращения позвоночника Системы введения генов являются основной технологией генной терапии и могут быть разделены на вирусные и невирусные векторные системы, из которых аденовирусные векторы были использованы в экспериментальных и доклинических исследованиях из-за их высокой эффективности трансфекции, простоты применения и способности производить высокие уровни продуктов экспрессии генов. Riew et al. использовали рекомбинантный аденовирус BMP2 (AdBMP2) для трансфекции аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга кролика (BMSC) in vitro и впоследствии имплантировали клетки с коллагеновым вектором в заднебоковой поперечный отросток L5-6 кролика, и обнаружили, что только у одного из пяти животных произошло сращение позвонков. Затем эта группа увеличила время трансфекции БМСК с AdBMP2 in vitro с 1 дня до 7 дней и обнаружила, что все экспериментальные животные достигли удовлетворительного сращения позвоночника.Riew et al. далее использовали AdBMP2 для трансфекции свиных БМСК in vitro и затем имплантировали модифицированные геном BMP2 свиные аутологичные клетки БМСК в грудной межпозвоночный диск с помощью минимально инвазивной торакоскопической техники и через 6 недель. Было подтверждено, что в экспериментальной группе было получено удовлетворительное переднее сращение между всеми шестью грудными позвонками. Wang et al. сравнили эффективность BMP2-модифицированных мышиных клеток BMSC и аутологичной кости при сращении задних боковых поперечных отростков в одном сегменте позвоночника мыши и обнаружили, что локальная генная терапия привела к образованию большого количества почти нормальной сфероидной кости между поперечными отростками, в то время как гистология образцов аутологичной кости для сращения показала тонкую, похожую на кружево сфероидную кость. Хидака и др. использовали трансфицированные AdBMP7 клетки костного мозга, культивированные в течение 4 недель in vitro и выращенные на аллогенном остеокондуктивном каркасе для создания искусственного костного материала, который впоследствии был пересажен в заднелатеральный отдел позвоночника голых мышей. Через 8 недель после операции данные визуализации и механики показали 70% и 80% сращения позвоночника, соответственно. Группа Хелма попыталась применить более простой метод содействия сращению позвоночника, вводя количество AdBMP2 или AdBMP9 чрескожно непосредственно в пояснично-крестцовые параспинальные мышцы голых мышей, и последующая компьютерная томография и гистология подтвердили удовлетворительное сращение позвоночника у животных. 2.2 Экспериментальное исследование опосредованной аденовирусом генной терапии минерализующего белка LMP-1 (LMP-1) для сращения позвоночника Практическое применение секреторных остеоиндуктивных факторов, подобных BMP, для сращения позвоночника у высших животных имеет ряд недостатков: 1) для эффективного сращения позвоночника требуются сверхфизиологические дозы белка BMP вплоть до миллиграммов, и трудно поддерживать эффективные физиологические концентрации белка BMP in vivo; 2) BMP 2) как секреторный остеоиндуктивный белок, BMP является лишь одним из членов сложного остеогенного пути с многофакторными взаимодействиями, и поэтому индукция остеогенеза только BMP не может полностью имитировать молекулярные механизмы, присущие сращению позвоночника; 3) физиологические побочные эффекты высоких доз BMP, применяемых in vivo, требуют дальнейшего изучения. Исходя из этого, Боден и др. успешно клонировали новую внутриклеточную сигнальную молекулу LMP-1 (LIM minialize protein) с помощью дифференциальной ПЦР, которая экспрессировалась за несколько часов до дифференцировки остеобластов и индуцировала экспрессию различных молекул BMP, таких как BMP2, 4, 6, 7 и других факторов роста в клетках-мишенях, трансфицированных геном LMP-1. факторы роста. Таким образом, как внутриклеточная сигнальная молекула, требуется лишь небольшое количество клеточной экспрессии для оказания каскада усиленных остеогенных эффектов и повышения остеогенной эффективности. Авторы предполагают, что LMP-1, как ранняя остеогенная внутриклеточная сигнальная молекула, может преодолеть недостатки BMP-подобных секреторных факторов и таким образом имитировать процесс остеогенеза в его физиологической форме. Боден и др. использовали липосомы в качестве средства переноса генов и обнаружили, что искусственная кость, созданная из композита клеток костного мозга крысы, трансфицированных LMP-1, и декальцинированного костного матрикса, эффективно способствовала сращению грудного и поясничного отделов позвоночника у голых крыс. Хотя эффективность трансфекции липосом, использованных в качестве векторов переноса генов в этом исследовании, составила всего 1% in vitro, эксперименты все же дали хорошие остеогенные результаты. Впоследствии они обнаружили, что аденовирус, рекомбинантный с LMP-1 (AdLMP-1), требует лишь очень низкого количества инфекционных комплексов (MOI = O.25 pfu/cell) при трансфекции остеогенных клеток-предшественников in vitro, что на несколько порядков ниже, чем при других видах генной терапии, использующих аденовирус в качестве вектора переноса генов. В исследовании слияния позвоночника кролика группа продемонстрировала, что AdLMP-1 (MOI=0,25-0,4pfu/cell) эффективно вызывал слияние между задними поперечными отростками поясничного отдела позвоночника кролика после трансфекции in vitro костного мозга кролика или клеток периферической крови и имплантации в декальцинированный костный матрикс или коллагеново-керамический комплекс. Далее Боден и др. изучили возможность клинического применения этих экспериментальных результатов, учитывая, что аденовирус-нейтрализующие антитела у ранее инфицированных людей могут повлиять на клиническую эффективность AdLMP-1 при лечении. Они воспроизвели кроличью модель предварительного инфицирования аденовирусом после предварительного введения кроликам аденовируса Ad5, а через 4 или 16 недель, при трансплантации аутологичных модифицированных геном LMP-1 клеток периферической крови для проведения кроличьих анализов слияния позвоночника, увеличили дозу вирусной инфекции или количество инфицированных клеток (MOI = 10 pfu/клетку, 1 × 107 клеток), а также увеличили продолжительность вирусной инфекции (30 мин) для преодоления гуморального иммунного отторжения и достижения удовлетворительных результатов сращения позвоночника. 2.3 Исследование генной терапии BMP7, опосредованной голой плазмидой, для сращения позвоночника Чтобы избежать возможных побочных эффектов вирусных векторов in vivo, некоторые ученые пытались применить невирусные векторы переноса генов для сращения позвоночника. Комплекс был имплантирован в заднюю латеральную мышцу поперечного отростка L5-6 у крыс SD. Гистологическое исследование через 2 и 4 недели после операции показало, что данный метод был успешным в индуцировании внутримышечного эктопического остеогенеза, но не привел к сращению позвоночника. Авторы предполагают, что общее количество белка BMP7, вырабатываемого в мышцах животных с помощью сконструированного комплекса голой плазмиды и коллагена, может быть недостаточным для успешного индуцирования сращения позвоночника. Будут проведены дальнейшие эксперименты по улучшению структуры голой плазмиды и оптимизации вектора, или по стимулированию производства белка BMP7 путем внутримышечного электропереноса, в надежде, что этот невирусный метод генной терапии с небольшим количеством побочных эффектов будет эффективен для стимулирования сращения позвонков. 2.4 Опосредованная ядерной трансфекцией невирусная генная терапия BMP6 для сращения позвонков Обычные методы трансфекции невирусных генов с помощью осаждения фосфата кальция, липосом и электропорации менее эффективны и более токсичны для клеток, что затрудняет их использование в клинической практике. Чтобы преодолеть это техническое препятствие, компания Amaxa Biotech (www.amaxa.com) недавно представила новый метод невирусной трансфекции генов — нуклеофекцию, который сочетает в себе технологии электропорации и липосом. Sheyn et al [18] выделили и культивировали мезенхимальные стволовые клетки, полученные из жировой ткани свиньи, и перенесли плазмиду BMP6 в клетки методом нуклеофекции in vitro, чтобы проверить эффективность трансфекции и экспрессии экзогенного гена in vitro. Затем эти трансгенные клетки были введены в паравертебральные мышцы голых мышей. Было показано, что метод ядерной трансфекции может эффективно опосредовать трансфекцию гена BMP6, а также вызывать сращение позвоночника у голых мышей с минимальными побочными эффектами. 2.5 Исследование коммерческих КМБ для сращения позвоночника В различных животных моделях сращения позвоночника КМБ, полученные с помощью рекомбинантных генетических методов, показали удовлетворительные результаты сращения, заложив основу для их перехода к клиническому использованию. Удовлетворительное сращение позвоночника было достигнуто у всех пациентов. В клинических условиях для эффективного сращения позвоночника требуется до миллиграммов коммерческих КМБ, а высокая стоимость ограничивает их клиническое применение. 3. Исследования безопасности генной терапии для сращения позвонков Хотя результаты исследований генной терапии для сращения позвонков на животных многообещающие, многие вопросы требуют решения в клинических условиях, такие как безопасность вирусных векторов и контролируемость экспрессии терапевтических генов, оптимизация посевных клеток, выбор скаффолд-векторов и комбинация нескольких генов. Среди них безопасность генной терапии является первым вопросом, который необходимо рассмотреть. 3.1 Безопасность вирусных векторов и контролируемость экспрессии терапевтических генов: Удаление всех вирусных генов из вирусных векторов при сохранении только цис-действующих элементов, необходимых для их репликации и упаковки, является направлением развития вирусных векторов. Эта стратегия максимизирует емкость вектора и снижает иммунотоксичность, индуцированную экспрессией вирусных белков. Ранние продукты экспрессии генов в геноме аденовируса лежат в основе клеточного и гуморального ответа в месте применения аденовируса in vivo, и это иммунное отторжение может привести к снижению уровня экспрессии терапевтических генов. Хотя введение в организм генетически модифицированных затравочных клеток позволяет избежать иммунного отторжения при непосредственном воздействии вируса на организм, исследования показали, что в некоторых случаях ранние продукты генов аденовируса, экспрессированные инфицированными аденовирусом клетками, могут выйти из клеток и вызвать реакцию иммунного отторжения. Поэтому производство безвирусных аденовирусов с удалением большинства вирусных генов является будущей тенденцией в использовании аденовирусных векторов, которые еще не применялись в исследованиях по заживлению костей. Вектор адено-ассоциированного вируса (AAV) был создан путем удаления всех компонентов вирусного генома с сохранением только длинных терминальных повторов на обоих концах, что делает его менее иммуногенным для применения in vivo. Внутримышечный эктопический остеогенез и отсутствие иммуновоспалительной реакции в месте инъекции. В отличие от вектора AAV, у иммунокомпетентных крыс за 24 часа до внутримышечного введения AdBMP2 требовалась доза иммуносупрессии для временного подавления иммунного ответа организма, прежде чем наблюдался значительный остеогенез. Ожидается, что вектор AAVBMP2/4 позволит добиться удовлетворительного сращения позвоночника в иммунокомпетентном организме путем многоточечного введения в заднебоковые поперечные мышцы сегментов позвоночника, требующих сращения. Эффективная экспрессия терапевтического гена — не единственное требование генной терапии, поскольку нерегулируемое проникновение гена в организм может иметь катастрофические последствия для организма. Хотя результаты исследований генной терапии для сращения позвоночника на животных многообещающие, для будущего клинического применения генной терапии с использованием стволовых клеток в качестве затравочных клеток будет особенно важно регулировать экспрессию терапевтических генов путем тщательного регулирования сроков, продолжительности и выхода экзогенной экспрессии генов, поскольку заживление кости обычно завершается в течение нескольких недель, и этот процесс не требует длительной и эффективной экспрессии экзогенных генов, таких как BMPs. Чрезмерное производство новой кости после длительной и эффективной экспрессии КМБ может вызвать ненужную компрессию нервных корешков и спинного мозга в районе сращения позвонков; кроме того, КМБ обладает множеством физиологических эффектов, и не следует недооценивать потенциальные системные побочные эффекты чрезмерных концентраций КМБ за пределами терапевтического окна. С разработкой безопасных, нетоксичных, активируемых триггером векторов, которые могут вызывать строгую регуляцию экспрессии генов на транскрипционном уровне, появился мощный инструмент для внедрения генной терапии в клиническую практику. Новое поколение систем экспрессии генов, регулируемых тетрациклином (Tet-on/off), эффективно решает проблемы токсического действия индукторов, выхода за пределы базовой линии и низкого уровня экспрессии и является одной из наиболее часто используемых систем регуляции экспрессии генов для будущего клинического применения. gazit et al. трансфицировали плазмиду экспрессии BMP2, регулируемую тетрациклином, ptTATop-BMP2 (Tet-off) в клетках C3H10T1/2. C3H10T1/2 клетками и отсеяли клоны клеток, стабильно экспрессирующих BMP2, и использовали клетки и коллагеновые губки в композите для восстановления костных дефектов лучевой кости у мышей. Это первая демонстрация того, что производное тетрациклина доксициклин (DOX) может регулировать экспрессию BMP2 у мышей и эффективно восстанавливать дефекты лучевой кости. Группа недавно ввела 2 x 106 этих клеток непосредственно в паравертебральные мышцы L2-L6 мышей C3H/HeN и добавила DOX в питьевую воду животных через 3, 7 и 30 дней после операции для прекращения экспрессии BMP2 и определения минимального окна экспрессии BMP2, необходимого для сращения позвоночника. Результаты показали, что животные были способны формировать новую кость в заднелатеральном отделе позвоночника через 4 недели и более зрелую пластинчатую кость через 8 недель для достижения прочного сращения позвоночника. Более того, было продемонстрировано, что минимальный временной промежуток в 7 дней для экспрессии BMP2 в этой модели сращения позвоночника был достаточным для того, чтобы вызвать образование новой кости, способствующей сращению позвоночника, что позволило впервые получить полезное представление о взаимосвязи между пространственной и временной экспрессией BMP2 и образованием новой кости. Кроме того, эксперимент не выявил местных или системных токсических эффектов в районе сращения позвоночника. Далее Газит и др. сконструировали тетрациклин-положительный (Tet-on) вектор AAVBMP2, который вводили непосредственно в черепные дефекты и паравертебральные мышцы мышей для эффективного восстановления черепных дефектов и содействия сращению позвонков. Авторы будут и далее исследовать кривую дозо-остеогенного ответа между DOX и производством новой кости, чтобы максимизировать естественный остеогенный паттерн и точно регулировать образование кости. 3.2 Исследования безопасности коммерческих КМБ для сращения позвоночника В клинической практике декомпрессия при ламинэктомии часто сопровождается одновременным сращением заднебокового межпоперечного отростка, переднего межтелового или заднего межтелового костного трансплантата. Martin et al. применили BMP2 к 17 обезьянам, подвергшимся ламинэктомии поясничного отдела позвоночника, для заднелатерального сращения поясничного отдела позвоночника и обнаружили только реактивное костеобразование в месте ламинэктомии без чрезмерного образования новой кости для компрессии спинного мозга. Результаты показали только реактивное костеобразование в месте ламинэктомии без чрезмерной выработки новой кости для сдавливания спинного мозга. В последующем исследовании Боден и др. имплантировали BMP2 в 24 поясничных ламинэктомированных обезьян с различными носителями в заднелатеральный межпоперечный отросток и не обнаружили остеогенеза в обнаженной твердой мозговой оболочке после ламинэктомии. Результаты этого исследования подтверждают, что BMP являются безопасными и эффективными в содействии сращению позвоночника. Прежде чем использовать генную терапию для сращения позвонков в клинических испытаниях, необходимо строго регламентировать принципы тестирования на животных генной терапии для сращения позвонков, при этом тестирование на животных должно проводиться по принципу «от низших животных к высшим». Из-за различий в физиологической и механической анатомии животных и человека данные, полученные в исследованиях на животных, следует с осторожностью экстраполировать на клиническое применение у человека. И наоборот, протоколы, которые не увенчались успехом в исследованиях на низших животных, неизбежно будут иметь трудности с успехом в более сложных условиях у человека. Поэтому генная терапия для заживления костей или сращения позвоночника, успешная на низших животных, должна быть успешной в исследованиях на нечеловеческих приматах, прежде чем она сможет пройти клинические испытания и в конечном итоге будет перенесена на клиническое применение у человека. В настоящее время экспериментальные исследования генной терапии для сращения позвоночника все еще ограничены исследованиями на мелких животных, и большинство из них посвящено одной заднебоковой межпоперечной схеме сращения позвоночника. Необходимо провести дальнейшие исследования на нечеловекообразных приматах для изучения бокового межпоперечного и межпозвонкового сращения, чтобы приблизиться к клинической практике. 5. Заключение Большое количество доклинических данных ясно показывает, что методы локальной генной терапии могут применяться для лечения заболеваний человека, но для пациентов, нуждающихся в восстановлении костной ткани, аутологичная костная пластика все еще является обычным клиническим методом лечения. В целом, методы генной терапии не являются необходимыми для всех пациентов. Однако для рефрактерного восстановления кости эта технология предлагает новый терапевтический путь. Кроме того, применяя стратегии генной терапии для лечения этих заболеваний, исследователи должны учитывать, что эти новые молекулярные методы лечения могут быть использованы для улучшения качества жизни пациентов, а не для лечения смертельных заболеваний. Поэтому в первую очередь необходимо рассмотреть вопрос о безопасности таких методов лечения. Аденовирусные векторы, которые идеально подходят для исследований на животных, должны быть усовершенствованы для будущего клинического применения, чтобы обеспечить значительную степень биобезопасности при их использовании. При дальнейшем совершенствовании методов генной терапии, которые являются безопасными, эффективными и позволяют точно регулировать терапевтические гены, ожидается, что методы генной терапии заменят традиционные клинические аутологичные костные трансплантаты в качестве рутинного средства содействия сращению позвоночника.