Анализ спермы является важным методом оценки мужской фертильности, а также лабораторной основой для диагностики и наблюдения за эффективностью мужских заболеваний. Однако параметры анализа спермы не являются специфическими, и невозможно определить способность к оплодотворению тех немногих сперматозоидов, которые достигают места оплодотворения, поэтому для правильной оценки мужской фертильности требуется комплексная оценка в сочетании с клиническими и другими тестами на функцию сперматозоидов.
Результаты анализа спермы могут быть необъективными из-за ряда факторов, включая частоту эякуляции, температуру, лабораторные условия, техническую квалификацию эксперта и субъективное суждение, поэтому сбор и анализ спермы должны проводиться в строгом соответствии с соответствующими стандартизированными процедурами, чтобы предоставить необходимую информацию о клиническом состоянии субъекта.
На первичной консультации бесплодной пары партнеру-мужчине следует провести как минимум два анализа спермы в соответствии со стандартными процедурами, а при наличии значительных различий между двумя анализами — третий анализ.
Образцы спермы могут содержать болезнетворные бактерии и вирусы (например, ВИЧ, вирус гепатита, вирус простого герпеса и т.д.) и поэтому должны считаться биологически опасными. Лаборанты должны соблюдать меры предосторожности и использовать одноразовые перчатки и посуду.
Использованную посуду следует дезинфицировать. Культуры спермы, используемые для биопроб, внутриматочного оплодотворения или оплодотворения in vitro, должны обрабатываться строго с использованием стерильных материалов и асептических операций.
I. Сбор и транспортировка образцов спермы
Стандартизация сбора спермы является предпосылкой для качественного анализа спермы, поэтому перед сбором спермы важно подробно проинформировать субъекта о методах и мерах предосторожности при сборе и сдаче спермы.
1. перед взятием образца следует воздерживаться от половой жизни не менее 48 часов, но не более 7 дней. Чтобы свести к минимуму колебания результатов анализа спермы, количество дней воздержания должно быть как можно более постоянным. В каждом отчете об анализе спермы должны быть указаны: имя пациента, продолжительность воздержания, дата и время взятия образца, был ли образец взят неповрежденным, а также промежуток времени между взятием и анализом образца.
2. у первичного обследуемого должно быть два анализа спермы, а интервал между двумя сборами спермы должен быть более 7 дней, но не более 3 недель. Если результаты двух анализов значительно отличаются друг от друга, необходимо повторно взять образец для третьего анализа.
3. сбор образца предпочтительно проводить отдельно в комнате для сбора спермы рядом с лабораторией. В противном случае он должен быть доставлен в лабораторию в течение 1 часа после сбора.
4. лучше всего брать сперму при мастурбации и собирать ее в стеклянный или пластиковый контейнер с широким горлом, который не оказывает токсического воздействия на сперматозоиды. Температура должна поддерживаться на уровне 20-40°C, чтобы избежать снижения жизнеспособности сперматозоидов. Если необходимо провести микробиологическое исследование, пациент должен сначала помочиться, вымыть руки и половой член и собрать в стерильный контейнер.
5. если мастурбация затруднена, для сбора спермы можно использовать специальные презервативы. Латексные презервативы не подходят для сбора спермы, так как они могут повлиять на выживаемость сперматозоидов. Прерванный половой акт также не подходит для сбора спермы, поскольку может быть потеряна начальная часть эякулята, а именно в этой части обычно самая высокая плотность сперматозоидов. Кроме того, образец может быть загрязнен бактериями и микроорганизмами женского репродуктивного тракта; также кислые вагинальные выделения могут оказывать пагубное влияние на жизнеспособность сперматозоидов.
6. сперма должна быть собрана целой, неполная сперма не подлежит анализу.
7. во время транспортировки в лабораторию температура образца должна поддерживаться выше 20°C, но не выше 40°C.
8. контейнер, в который собирается сперма, должен быть помечен именем (и/или идентификационным номером) субъекта, а также датой и временем взятия образца.
II. Визуальное наблюдение за спермой
1. разжижение спермы
При комнатной температуре сперма застывает сразу после эякуляции, а затем вступает в процесс разжижения, который обычно завершается в течение 15 минут. Поэтому рекомендуется наблюдать за разжижением через 20, 30 и 60 минут после изъятия и записывать время, затраченное на разжижение, и то, завершилось ли оно. Нормальная сперма может содержать желеобразные частицы, которые не разжижаются, и это явление не имеет клинического значения.
Длительное разжижение спермы, неполное разжижение или отсутствие разжижения обычно связано с гипосекрецией простаты и дефицитом протеолитических ферментов.
Не разжиженная сперма требует отдельной обработки, либо механического перемешивания, либо переваривания ананасовой протеазой (ананасовая протеаза 1 г/л).
Добавление равного количества культуральной жидкости и повторное продувание с помощью спаржера также может разжижить некоторые образцы. Следует отметить, что все эти методы лечения могут повлиять на биохимию семенной плазмы, жизнеспособность спермы и результаты морфологии сперматозоидов.
2. Внешний вид спермы
После разжижения образец спермы следует сначала визуально осмотреть при комнатной температуре. Нормальная сперма однородна и беловата по консистенции, а после длительного воздержания может быть слегка желтой. Если плотность сперматозоидов очень низкая или отсутствует, сперма может казаться жидкой. При наличии эритроцитов сперма может выглядеть красновато-коричневой. Если есть желтуха или если принимаются определенные витамины, сперма может выглядеть желтой.
3. объем спермы
Объем спермы можно измерить с помощью градуированного цилиндра с коническим основанием. У нормальных мужчин объем спермы составляет не менее 2 мл за эякуляцию, а низкий объем спермы часто связан с потерей части спермы при заборе спермы. Если сперма не теряется, объем ее небольшой и не свертывается, сперматозоиды отсутствуют, а семенные каналы при физикальном обследовании отсутствуют, следует подумать о врожденном недоразвитии семенной железы.
4. вязкость спермы
Консистенцию можно оценить, осторожно вдыхая сперму через пипетку с широким отверстием объемом 5 мл. Нормальная сперма образует прерывистые капли в устье пипетки под действием силы тяжести, в то время как в случае аномальной вязкости капли образуют вытянутые капли длиной >2 см.
Другой метод определения вязкости заключается в том, чтобы ввести стеклянную палочку в сперму, поднять палочку и наблюдать за длиной деформации, которая считается ненормальной, если превышает 2 см. Сперма высокой вязкости может препятствовать движению сперматозоидов.
5. значение PH
Значение PH должно быть измерено в течение 1 часа после эякуляции. Каплю спермы следует поместить на бумагу для PH-теста (диапазон PH-теста 6,1 — 10,0 или 6,4 — 8,0). Через 30 секунд цвет смоченной области должен стать однородным, а значение PH следует считать, сравнив его со стандартной полоской. Какая бы бумага для определения PH ни использовалась, ее точность должна быть проверена с помощью известных стандартов.
III. Микроскопическое исследование спермы
Микроскопическое исследование спермы включает определение плотности сперматозоидов, подвижности сперматозоидов, жизнеспособности сперматозоидов, агглютинации сперматозоидов, компонентов клеток, не относящихся к сперматозоидам, и морфологический анализ сперматозоидов.
Для микроскопии спермы рекомендуется использовать фазово-контрастный микроскоп. Можно использовать и обычный световой микроскоп, но с хорошо настроенным концентратором.
1. подготовка образцов для микроскопического исследования
Объем отобранной спермы и размер покровного стекла должны быть стандартизированы таким образом, чтобы сперма анализировалась при толщине около 20 мкм. Плотность сперматозоидов должна быть приблизительно определена перед точным определением. Это делается путем.
С помощью спикера поместите каплю спермы объемом 10 мкл на чистое предметное стекло и накройте покровным стеклом размером 22L x 22L. Покровное стекло взвешивают, чтобы распределить образец для оптимального просмотра, стараясь избежать образования воздушных пузырьков между покровным стеклом и предметным стеклом.
Дайте постоять 1 минуту для стабилизации. Тест можно проводить при комнатной температуре от 20 до 24°C. Важно стандартизировать температуру в лаборатории, так как температура влияет на оценку жизнеспособности сперматозоидов. Жизнеспособность и подвижность сперматозоидов сильно зависят от температуры, поэтому для оценки жизнеспособности рекомендуется использовать изолированный зеркальный стол с постоянной температурой стола 37°C.
Подготовленные образцы следует наблюдать под 100-кратным микроскопом на предмет образования нитей слизи, агглютинации сперматозоидов и равномерности распределения образца на предметном стекле перед исследованием под 400-кратным микроскопом.
2. первичное исследование плотности сперматозоидов
Перед точным подсчетом плотности сперматозоидов проводится предварительное исследование, результаты которого служат основанием для разбавления спермы. Диаметр поля зрения при 400-кратном увеличении варьируется от микроскопа к микроскопу и обычно составляет от 250 до 400 мкм в диаметре, что эквивалентно 1-2,5 нл для образца толщиной 20 мкм.
Диаметр поля зрения можно определить по линейке микроскопа или по сетке в счетной ячейке. Количество сперматозоидов в каждом поле зрения подсчитывается и умножается на 106/мл для получения приблизительной оценки плотности сперматозоидов в образце спермы. Эта оценка используется для определения разведения плотности сперматозоидов, измеренной с помощью гематокритной пластины: 200 сперматозоидов при разведении 1:50.
Если количество сперматозоидов на поле зрения значительно варьируется, образец неоднороден. В этом случае образец спермы следует снова перемешать, повторно взять пробу и провести анализ. Ненормальная консистенция спермы, неполное разжижение, агрегация сперматозоидов в нити слизи или агглютинация сперматозоидов — все это может повлиять на смешивание спермы.
Если количество сперматозоидов низкое (менее 1-2 на поле зрения при 400х), образец может быть сконцентрирован центрифугированием перед определением плотности сперматозоидов. Возьмите 1 мл спермы (или как можно больше спермы) и центрифугируйте при 600g в течение 15 минут. Известный объем семенной плазмы отбрасывается, хорошо перемешивается, преципитируется и подсчитывается.
Конечная плотность корректируется с учетом объема отброшенной семенной плазмы. После центрифугирования образец можно также оценить на жизнеспособность и морфологию сперматозоидов. Если после центрифугирования и концентрации количество сперматозоидов все еще низкое (менее 1 или 2 на поле зрения), сообщите плотность сперматозоидов как 3 000 г при центрифугировании в течение 15 минут. Заключение об азооспермии может быть вынесено только после повторного взвешивания всего осадка и тщательного и систематического обследования, выявляющего отсутствие сперматозоидов.
3. Оценка подвижности сперматозоидов
Подвижность сперматозоидов — это способность сперматозоидов двигаться вперед. Для оперативных целей подвижность сперматозоидов классифицируется на четыре уровня: a, b, c и d.
Класс «a»: быстрое движение вперед (т.е. скорость ≥ 25 мкм/с при 37°C, или скорость ≥ 20 мкм/с при 20°C).
Класс «b»: медленное или вялое движение вперед.
Класс «c»: движение не вперед.