I. Вирусологические основы устойчивости к аналогам нуклеозидов (кислот)
После проникновения HBV в организм, он связывается с рецепторами на мембране клетки-мишени, сбрасывает свою оболочку и попадает в цитоплазму, сбрасывая ядерный капсид, часть двухцепочечной циклической HBVDNA попадает в ядро клетки-мишени, и под действием ДНК-полимеразы использует отрицательно заряженную ДНК в качестве шаблона для удлинения положительной нити и восстановления области расщепления, образуя ковалентную замкнутую ДНК (cccDNA). Репликация HBVDNA сначала использует cccDNA как Шаблон транскрибируется в 3, 5kb, 2, 4kb, 2, 1kb и 0, 7kb под действием РНК-полимеразы хозяина.
Хотя HBV является ДНК-вирусом, процесс его репликации — это не прямой процесс репликации ДНК-ДНК, а промежуточный процесс прегеномной РНК, т.е. репликация ДНК-РНК-ДНК. В процессе обратной транскрипции прегеномной РНК в негативно-цепочечную ДНК, обратная транскриптаза HBV не имеет строгого механизма коррекции, что приводит к высокой частоте нуклеотидных несоответствий во время репликации HBV, которая составляет около 1/105 между другими ДНК и РНК вирусами. этот процесс и характеристика репликации HBV определяет, что существуют различия в последовательностях генов между различными штаммами HBV у одного и того же пациента. Таким образом, вирус у каждого пациента представляет собой динамически изменяющуюся вирусную популяцию, состоящую из вирусных штаммов с различиями в генетической последовательности, т.е. HBV существует как квазивид.
Эволюция вирусной популяции HBV также согласуется с дарвиновской эволюцией. Мутации в некоторых локусах могут быть летальными, и HBV, подвергшийся таким мутациям, не может выжить. Изменения в некоторых локусах не оказывают существенного влияния на способность к репликации, но изменения во многих локусах приводят к снижению или усилению репликации вируса потомства. Относительная доля вирусных штаммов с различными генетическими последовательностями в вирусной популяции зависит от способности к репликации самих штаммов, с одной стороны, и подвержена селективному давлению иммунной системы организма или лекарств, с другой стороны.
Механизм действия аналогов нуклеозидов (кислот): при попадании в организм они образуют трифосфатный активный компонент, который конкурентно связывается с естественным дезокситрифосфатным нуклеозидом организма для полимеразы HBV. Однако синтез нити ДНК HBV прекращается, поскольку трифосфорилированные аналоги нуклеозида (кислоты) не обладают структурой природного dNTP, что является механизмом, с помощью которого аналоги нуклеозида (кислоты) ингибируют репликацию HBV. Однако если последовательность HBV у пациента мутирована, что приводит к образованию полимеразы HBV с пониженной способностью связываться с нуклеозидным аналогом, то мутированный HBV либо не ингибируется нуклеозидным аналогом, либо его способность к ингибированию снижается. Поэтому, если терапия нуклеозидными аналогами продолжается, дикий штамм будет продолжать подавляться, поскольку он чувствителен к нуклеозидным аналогам; мутантный штамм постепенно заменит дикий штамм и станет доминирующим штаммом HBV в организме, поскольку он обладает определенной способностью к репликации и не чувствителен к нуклеозидным аналогам, что приведет к лекарственной устойчивости пациентов к нуклеозидным аналогам.
II. Концепции и номенклатура, связанные с вариантами устойчивости к нуклеозидным (кислотным) аналогам
(I) Концепции, связанные с вариантами лекарственной устойчивости
Общепринятые термины или понятия, связанные с лекарственно-устойчивыми вариантами ВГВ, следующие
1. первичное отсутствие ответа: относится к 12 неделям лечения аналогами нуклеозидов (кислот) и снижение нагрузки HBVDNA менее 1log10IU/мл. Первичная неудача лечения может быть связана с такими факторами, как хозяин, препарат или вирус: плохое соблюдение пациентом режима лечения, нарушение всасывания препарата, плохая способность преобразования препарата в активные вещества в организме; слабая противовирусная эффективность препарата или слишком маленькая терапевтическая доза; устойчивость к препарату в HBV Неудача первичного лечения может быть вызвана мутациями и т.д.
2, вирусологический прорыв: относится к двум последовательным обследованиям с разницей в 1 месяц в течение курса лечения, повышение нагрузки HBVDNA в сыворотке крови по сравнению с самым низким значением после получения ответа превышает 1log10, вирусологический прорыв у пациентов с хорошим соблюдением лечения часто указывает на развитие резистентности к препаратам.
3. Вирусный рецидив: относится к пациентам, которые достигли вирусологического ответа после лечения и у которых нагрузка HBVDNA повышается на ≥20 000 МЕ/мл или выше уровня до лечения, несмотря на продолжающееся лечение.
4.Биохимический прорыв: означает повышение уровня АЛТ и превышение верхней границы нормы во время продолжения лечения после достижения нормализации уровня АЛТ в сыворотке крови. Когда уровень АЛТ повышается более чем в 5 раз по сравнению с верхней границей нормы, это называется прорывом гепатита.
5. первичная лекарственно-устойчивая мутация: речь идет о мутации гена и аминокислоты, закодированной в целевом сайте лекарственного препарата, что приводит к снижению восприимчивости мутантного штамма вируса к терапевтическому препарату. Например, мутантный штамм rtM204V/I обладает значительно сниженной восприимчивостью к LAM. Хотя первично-устойчивые мутантные штаммы обладают повышенной устойчивостью к лекарствам, они также часто приводят к снижению способности к репликации самого мутантного вируса.
6. вторичные лекарственно-устойчивые мутации: Вследствие снижения способности к репликации первичного лекарственно-устойчивого мутантного штамма, штамм может мутировать и по другим локусам на основе первичной лекарственно-устойчивой мутации, и эти мутации могут частично восстановить способность к репликации мутантного вируса или привести к дальнейшему снижению восприимчивости мутантного вируса к лекарствам. Например, среди лекарственно-устойчивых вариантов LAM, rtM204V/I является основным лекарственно-устойчивым вариантом, часто сопровождаемым вариантом rtL180M, который является компенсаторным лекарственно-устойчивым вариантом.
7. генотипическая резистентность: относится к обнаружению вариантов ВГВ, которые, как было показано, связаны с резистентностью к противовирусным препаратам в исследованиях фенотипического анализа in vitro.
8. фенотипическая резистентность: варианты ВГВ, которые были подтверждены системами репликации in vitro, снижающими их восприимчивость к противовирусным препаратам. Если EC50, необходимый для ингибирования вирусной репликации, увеличивается более чем в 100 раз по сравнению с диким штаммом, его называют высокоустойчивым, 10-99-кратным умеренно устойчивым и 2-9-кратным слабоустойчивым.
9. перекрестная резистентность: варианты ВГВ, устойчивые к одному аналогу нуклеозида (кислоты), также устойчивы к одному или нескольким другим аналогам нуклеозида (кислоты). Например, при лечении LAM возникает резистентный вариант rtM204I, который также устойчив к LdT.
10, множественная лекарственная устойчивость: относится к случаям, когда различные целевые препараты для последовательного или одновременного лечения, HBV может произойти в мишени различных препаратов мутации устойчивости, производство множественных лекарственно-устойчивых мутантных штаммов вируса. Если после лечения LAM возникают вирусные мутации в rtM204V/I и rtA181T/V, штамм становится устойчивым как к LAM, так и к ADV.
Генетические мутации являются основой вирусной резистентности. В клинике сначала происходят генетические изменения, затем вирусологический прорыв и вирусная реакция, а затем биохимический прорыв. Интерпретация результатов клинического теста на вирусную резистентность должна быть интегрирована с изменениями вирусной нагрузки, реагентов и методов тестирования и клинической картины.
(ii) номенклатура и формат написания данных о лекарственной устойчивости
Полимеразу HBV можно разделить на четыре различных функциональных региона: терминальный белок, спейсерный регион и регион обратной транскриптазы. Все известные варианты лекарственной устойчивости расположены в области обратной транскриптазы. 8 генотипов обратной транскриптазы HBV состоят из 334 аминокислотных остатков, поэтому современные международные генерические варианты лекарственной устойчивости HBV начинаются с первого аминокислотного остатка rt и записываются в формате «rt — аббревиатура аминокислоты дикого типа — место изменения аминокислоты относительно начальной точки области обратной транскриптазы — изменение после Например, rtM204V означает, что положение 204 области обратной транскриптазы мутировано с метионина (M) на валин (V). При наличии более двух аминокислотных изменений на одном участке, т.е. смешанной вирусной группы HBV, следует перечислить оба аминокислотных изменения.
Общие сайты устойчивости и частота мутаций для нуклеозидных (кислотных) аналогов
1, варианты, связанные с устойчивостью к ламивудину: имеющиеся исследования показывают, что распространенными вариантами, связанными с устойчивостью к ламивудину, являются варианты rtM204I/V±rtL180M, из которых варианты rtM204V в основном встречаются в сочетании с вариантами rtL180M, а варианты rtM204I могут встречаться отдельно. Кумулятивная частота резистентности в течение 1-5 лет по данным опубликованных первичных исследований у пациентов, получавших лечение LAM первичными аналогами нуклеозидов (кислот), составила 24%, 38%, 49%, 67% и 70% соответственно.
2. Варианты, ассоциированные с резистентностью к адефовиру: Имеющиеся исследования показывают, что распространенными вариантами, ассоциированными с резистентностью при АДВ, являются варианты rtN236T и rtA181V/T, которые могут встречаться по отдельности или в комбинации. Кумулятивная частота резистентности у HBeAg-негативных пациентов в 1-5 лет составляла 0%, 3%, 11%, 18% и 29%, соответственно, на основании опубликованных данных из первичных клинических испытаний пациентов, получавших лечение нуклеозидными (кислотными) аналогами ADV.
3. Варианты, ассоциированные с резистентностью к энтекавиру: Текущие результаты показывают, что варианты, ассоциированные с резистентностью к ETV, основаны на варианте rtM204V+rtL180M в сочетании с вариантами аминокислотных замен по крайней мере в одном из трех локусов rtT184, rtS202 или rtM250. Кумулятивная резистентность в период от 1 до 5 лет на основании опубликованных данных о поворотных клинических испытаниях ETV у пациентов, получавших первичное лечение аналогами нуклеозидов (кислот).
4. Варианты, ассоциированные с резистентностью к телбивудину: Текущие результаты показывают, что распространенным вариантом LdT, ассоциированным с резистентностью, является rtM204I. Другие участки, такие как rtA181V/T, все еще остаются спорными. Кумулятивная частота резистентности на 1 и 2 год, основанная на опубликованных данных, полученных в ходе поворотных клинических испытаний LdT у пациентов, получавших лечение первичными аналогами нуклеозидов (кислот), составляет 4% и 22%, соответственно.
Следует отметить, что популяции и модели хронического гепатита В, задействованные в каждом из этих препаратов, отличаются.
Выявление и анализ лекарственно-устойчивых вариантов вируса гепатита В
(a) Общие генотипические методы выявления лекарственной устойчивости
Метод прямого секвенирования продуктов ПЦР — это метод, который амплифицирует область обратной транскриптазы генома HBV и затем непосредственно секвенирует ее для анализа. Недостатком этого метода является то, что он менее чувствителен и может быть обнаружен только тогда, когда вариант превышает 20% от пула квазивидов HBV.
2. полимеразная цепная реакция — полиморфизм длины рестрикционного фрагмента: этот метод обладает высокой чувствительностью и может выявлять лекарственно-устойчивые варианты, составляющие 5% от квазивидового пула HBV, и используется многими лабораториями в стране и за рубежом для выявления лекарственно-устойчивых вариантов LAM. Однако ПЦР-РФЛП может выявлять только известные, односайтовые варианты и является простым, быстрым и недорогим методом для мониторинга небольшого числа устойчивых вариантов. Однако с появлением многочисленных нуклеозидных (кислотных) аналогов и возникновением вариантов резистентности ВГВ этот метод не подходит для выявления мультилокусных вариантов.
3. обратная гибридизация: метод INNO-LiPA, основанный на этой технологии, был одобрен для клинических испытаний за рубежом и в настоящее время может выявлять общие локусы резистентности, включая LAM, ADV, ETV и LdT. Метод может обнаружить варианты штаммов, составляющих от 5% до 10% от квазивидового пула HBV, поэтому чувствительность хорошая, но он также может обнаружить только известные варианты локусов, кроме того, тест дорогой, его трудно широко использовать в клинических испытаниях в Китае.
4. ПЦР в реальном времени: этот метод прост в использовании и может выявлять лекарственно-устойчивые варианты с уровнем вариации менее 10%. Недостатком является то, что можно обнаружить только известные сайты; в то же время, различные варианты для каждого сайта требуют синтеза соответствующего зонда, и по мере увеличения количества сайтов устойчивости к нуклеозидным (кислотным) аналогам стоимость соответствующих синтетических зондов возрастает. В Китае доступны одобренные SFDA наборы для ПЦР в реальном времени для клинического тестирования вариантов rtM204V/I.
5, генный чип: также известен как ДНК-чип, ДНК-микрочип, с преимуществами быстрого, эффективного, чувствительного, параллелизации и автоматизации, может обнаружить известные варианты локусов. Кроме того, с развитием технологии высокопроизводительного секвенирования генных чипов, он также может быть использован для обнаружения неизвестных локусов вариантов. В настоящее время разрабатываются отечественные микрочипы для клинического тестирования аналогов нуклеозидов (кислот).
6, технология полиморфизма масс-спектрометрии рестрикционных фрагментов: эта технология представляет собой сочетание технологии PCR-RFLP и технологии масс-спектрометрии с матричной лазерной десорбцией и ионизацией по времени пролета, которая является высокочувствительной и может обнаружить ряд вариантных штаммов с менее чем 1% от пула квазивидов HBV, но она также способна обнаружить только известные варианты локусов и является дорогой, что затрудняет ее применение в клинике.
(ii) Фенотипирование in vitro
Фенотипирование in vitro является «золотым стандартом» для подтверждения генотипической резистентности и часто используется для оценки уровня резистентности при полуэффективных концентрациях. Принцип заключается в том, что в клеточную линию гепатоцитов вводится весь геном HBV, содержащий тестируемый лекарственно-устойчивый вариант, затем в среду клеточной культуры добавляются аналоги нуклеозидов (кислот) в различных градиентах концентрации, и после определенного времени инкубации выявляется репликация HBVDNA под действием препарата и рассчитывается EC50. восприимчивость.
(iii) Виртуальный анализ фенотипа
Необходимым условием для виртуального фенотипирования является создание базы данных лекарственно-устойчивых вариантов ВГВ, содержащей взаимосвязанную клиническую информацию, генотипы и информацию о фенотипической резистентности. Когда последовательность передается в базу данных для анализа, база данных будет искать наиболее близко совпадающую последовательность HBV и делать вывод о вариации лекарственной устойчивости анализируемой последовательности на основе клинического тестирования и тестирования лекарственной устойчивости совпадающей последовательности. Как вспомогательное средство для изучения фенотипической резистентности, виртуальное фенотипирование не заменит фенотипирование in vitro, но облегчит мониторинг известных вариантов резистентности и открытие новых вариантов. В настоящее время доступны базы данных Австралии.
V. Клиническое ведение лекарственно-устойчивых вариантов вируса гепатита В
(i) Предсказатели лекарственно-устойчивых вариантов вируса гепатита В
Вероятность возникновения устойчивости ВГВ к аналогам нуклеозидов (кислот) может быть связана с целым рядом факторов, включая тип применяемых аналогов нуклеозидов (кислот), нагрузку HBVDNA при первоначальном лечении, наличие фиброза/цирроза печени и предыдущее противовирусное лечение аналогами нуклеозидов (кислот). Кроме того, пациенты мужского пола, высокий индекс массы тела и злоупотребление алкоголем также являются факторами высокого риска возникновения мутаций резистентности при противовирусной терапии. Однако растущее число исследований свидетельствует о том, что ранний вирусологический ответ является важным предиктором частоты возникновения лекарственной устойчивости.
(ii) стратегии профилактики лекарственно-устойчивых мутаций вируса гепатита В
1. рациональный выбор показаний к противовирусной терапии аналогами нуклеозидов (кислот): аналоги нуклеозидов (кислот) не рекомендуется назначать людям с иммунной толерантностью или неактивной инфекцией ВГВ, особенно в молодых возрастных группах, не требующих лечения иммуносупрессивными или химиотерапевтическими препаратами. Для пациентов с впервые выявленной активной хронической инфекцией ВГВ, особенно молодого возраста, решение об использовании аналогов нуклеозидов (кислот) должно приниматься с осторожностью, путем полного анализа предрасполагающих факторов.
2. рациональный выбор схемы противовирусного лечения: рекомендуется использовать схему лечения в соответствии с Китайскими рекомендациями по профилактике и лечению хронического гепатита В. Для пациентов с показаниями к противовирусной терапии, если используются аналоги нуклеозидов (кислот), старайтесь использовать препараты с сильным противовирусным действием и низкой частотой вариаций лекарственной устойчивости; в то же время, важно понимать предыдущую противовирусную терапию, включая применение аналогов нуклеозидов (кислот), ответ на лечение и вариации лекарственной устойчивости, чтобы выбрать лекарственную терапию без перекрестной резистентности. Кроме того, следует максимально избегать последовательной терапии одним препаратом, чтобы избежать возникновения множественной лекарственной устойчивости.
3. Повышение комплаентности пациентов: Во время противовирусного лечения аналогами нуклеозидов (кислот) важно неоднократно подчеркивать соблюдение рекомендаций врача по своевременному приему препаратов в адекватных дозах. Анализ данных клинических испытаний показывает, что более 30% вирусологических прорывов вызваны плохим соблюдением пациентом режима лечения. В любом случае, сужающийся режим дозирования является неправильным и значительно повышает риск развития лекарственной устойчивости.
4. стандартизированный мониторинг HBVDNA и генотипической резистентности для своевременной корректировки схем лечения: нагрузка HBVDNA является наиболее важным показателем мониторинга резистентности при применении нуклеозидных (кислотных) аналогов для противовирусной терапии. Во время лечения необходимо регулярно проверять уровень HBVDNA. Большое количество клинических исследований показало, что ранний вирусологический ответ является важным предиктором частоты возникновения лекарственной устойчивости, поэтому и APASL, и EASL рекомендуют корректировать схемы лечения в зависимости от раннего вирусологического ответа для повышения эффективности и снижения частоты возникновения лекарственной устойчивости.
Генотипическое тестирование на резистентность не рекомендуется в качестве рутинного теста для противовирусной терапии нуклеозидными аналогами. Генотипическое тестирование на резистентность следует проводить у пациентов, у которых наблюдаются вирусологические прорывы во время терапии нуклеозидными аналогами, если нет четких доказательств того, что исходный пациент инфицирован HBV от пациента, получающего противовирусную терапию нуклеозидными аналогами. Генотипическое тестирование на резистентность у пациентов, получающих первичное лечение, обычно не рекомендуется.
(iii) Рекомендации по клиническому ведению пациентов, у которых развились варианты с лекарственной устойчивостью
Для меньшинства пациентов с нормальной АЛТ до лечения и легкими воспалительными или фиброзными поражениями при гистологическом исследовании печени.