За последнее десятилетие количество препаратов, одобренных для лечения хронического гепатита В в Китае, увеличилось с одного обычного интерферона до шести препаратов, включая пегилированный интерферон, ламивудин, адефовир, энтекавир и типифудин, а также тенофовир и эмтрицитабин за рубежом. Хотя нуклеозидные (кислотные) препараты легче принимать и они имеют меньше побочных эффектов, чем интерферон, они часто не обеспечивают устойчивой вирусной супрессии после прекращения 48-недельного курса, и курс продлевается, возможно, на неопределенный срок. Длительное применение этих препаратов может быть связано с повышенным риском развития вирусной резистентности. Вирусная резистентность и низкая комплаентность пациентов являются двумя наиболее важными причинами неудачи противовирусной терапии хронического гепатита В.
Неудача лечения нуклеозидными (кислотными) препаратами определяется как первичная неудача лечения (отсутствие ответа на начальную терапию) и вторичная неудача лечения, определяемая как снижение концентрации ДНК вируса гепатита В (HBV) в сыворотке крови менее 1 x log10 МЕ/мл в течение трех месяцев после начала противовирусной терапии, а вторичная неудача лечения определяется как эффективная начальная противовирусная терапия (снижение концентрации ДНК HBV в сыворотке крови больше или равно 1 x log10 МЕ/мл в течение трех месяцев). Вирусная мутация и лекарственная устойчивость являются наиболее важными причинами вторичной неудачи лечения.
I. Особенности репликации вируса гепатита В и возникновения его мутаций
В процессе репликации ДНК ВГВ необходим процесс обратной транскрипции, а поскольку вирусная обратная транскриптаза лишена 3′-5′ нуклеотидной экзонуклеазной активности, она не способна вычитывать несовпадающие нуклеотиды (кислоты), в результате чего частота естественных ошибок при репликации ДНК ВГВ примерно в 10 раз выше, чем у других ДНК-вирусов. Естественная вариация гена HBV в процессе репликации часто приводит к появлению квазивидов — группы вирусных штаммов с очень похожими, но не идентичными генетическими последовательностями у нелеченных HBV-инфицированных пациентов. Из-за перекрывающихся характеристик рамок считывания ДНК HBV большинство квазивидов ДНК HBV приводят к снижению их репликативной способности, при этом доминирующим штаммом в данной среде является квазивид с наибольшей репликативной способностью при заданном давлении отбора.
Наличие пула вариантных штаммов HBV (квазивидов) под давлением эндогенного (иммунный ответ хозяина) и экзогенного (противовирусные препараты или процесс передачи вируса) отбора обеспечивает преимущество для выживания HBV, позволяя присутствовать вариантным штаммам, убегающим до иммунного ответа (убегание пре-С региона или e антигена), профилактических вакцин (убегание вакцин) и противовирусных препаратов (устойчивость вируса).
Устойчивость ВГВ к противовирусным препаратам отражает снижение восприимчивости вируса к лекарственному ингибированию, обусловленное адаптивной мутацией вируса под селективным лекарственным давлением. Были выявлены два типа вариантов резистентности: основные варианты резистентности, которые непосредственно снижают восприимчивость вируса к лекарствам, и компенсаторная резистентность, которая может усиливать вирусную репликацию, поскольку основные варианты резистентности, как правило, сопровождаются снижением пригодности вируса к репликации.
Важность компенсаторных лекарственно-устойчивых вариантов заключается в их способности компенсировать недостаток лекарственно-устойчивых вариантов в генофонде квазивидовой памяти. Признаки появления лекарственно-устойчивых вариантов включают увеличение вирусной нагрузки, обычно с надира >1logIU/мл, и/или наличие известных генетических маркеров устойчивости в области вирусного полиморфа, повышение уровня глутаминазы в сыворотке крови и, в конечном итоге, ухудшение клинических симптомов.
II. Факторы, связанные с развитием резистентности к вирусу гепатита В
Развитие резистентности ВГВ зависит, по крайней мере, от шести факторов.
(1) Количество и скорость вирусной репликации;
(2) верность вирусной полимеразы;
(3) Давление выбора препарата;
(4) общий объем печеночного пространства для репликации;
(5) Адаптация к репликации лекарственно-устойчивых вирусных штаммов;
(6) генетический барьер для препарата.
1. Количество и скорость вирусной репликации Высокая скорость обновления вируса вследствие высокой репликации HBV приводит к тому, что концентрация циркулирующих вирусов в сыворотке крови хронически инфицированных пациентов часто превышает 108-1010 вирусных частиц/мл. Если предположить, что период полураспада циркулирующего вируса составляет один день, то каждый день образуется более 1011 новых вирусных частиц. Геном HBV имеет 3200 пар оснований, а частота несоответствий полимеразы составляет от 10-4 до 10-5/основание/цикл, что приводит к большому количеству мутировавших геномов (квазивидов) в общем циркулирующем вирусе, так что каждое основание может меняться ежедневно.
Поддержание стабильности доминирующего штамма в квазивидовом пуле ВГВ зависит от специфического давления отбора со стороны врожденной и адаптивной иммунных систем хозяина, а также от способности самого вируса выживать и реплицироваться.
2. скорость мутаций HBV варьирует от 1,4 до 3,2 x 10-5 аминокислотных замен/сайт/год, что примерно в 10 раз больше, чем у других ДНК-вирусов и соответствует РНК-вирусам, таким как ретровирусы. В отличие от клеточных полимераз, полимераза ВГВ является обратной транскриптазой и не обладает корректирующей активностью. В связи с наличием квазивидового пула HBV, возможно, что мутантный штамм с одной или двумя мутациями, связанными с лекарственной устойчивостью, может существовать до начала противовирусной терапии.
3. давление отбора для лекарств Шанс отбора вариантов, вызывающих резистентность, во время лечения зависит от силы действия лекарства, и этот шанс может быть выражен в виде колоколообразной кривой. Препараты с низкой противовирусной эффективностью не оказывают значительного давления отбора на вирус, и риск появления резистентных штаммов невелик. И наоборот, поскольку мутация зависит от вирусной репликации, препараты, полностью подавляющие вирусную репликацию, также дают мало возможностей для возникновения мутации.
Поскольку монотерапия оказывает противовирусное действие в разной степени только на один участок-мишень, она имеет высокую вероятность селекции резистентных вариантов. Идеальная схема лечения подавляет вирус на разных стадиях его жизненного цикла, тем самым значительно снижая риск развития лекарственной устойчивости. В присутствии давления отбора лекарств устойчивость может возникнуть только при наличии вирусной репликации.
4. Общее печеночное пространство репликации Под пространством репликации HBV понимается потенциал печени для размещения новых транскрипционных шаблонов или молекул ккДНК. Это говорит о том, что конечная рецепция вирусных вариантов зависит от истощения исходного дикого штамма вируса и находится под влиянием других факторов, таких как адаптация вирусной репликации, а также пролиферация и обновление гепатоцитов. В нормальной печени обновление гепатоцитов происходит медленно, период полураспада составляет около 100 дней. При воспалительной активности и токсичности период полураспада снижается до менее чем 10 дней.
В полностью инфицированной печени зарождающиеся молекулы кцДНК HBV синтезируются только во время генерации неинфицированных гепатоцитов, которые могут быть получены в результате нормального роста печени, пролиферации и обновления гепатоцитов или истощения кцДНК из вируса дикого типа в инфицированных гепатоцитах.
Пригодность к репликации лекарственно-устойчивых штаммов вирусов Пригодность к репликации можно определить как способность генерировать потомство под давлением естественного отбора и измеряется не урожайностью, а конкурентными анализами коинфекции in vitro, но этот метод не применим к HBV из-за отсутствия подходящих систем клеточных культур для инфекции HBV. Thibault и др. впервые сообщили о передаче резистентного к ламивудину HBV между пациентами; другие группы обнаружили, что резистентные к ламивудину штаммы могут сосуществовать с HBV дикого типа в качестве доминирующих штаммов в течение как минимум трех месяцев после прекращения приема препарата, а с HBV дикого типа в качестве недоминирующих штаммов — примерно через год после прекращения приема препарата.
Генетическим барьером для нуклеозидных (кислотных) препаратов является количество нуклеотидных мутаций, необходимых для основных вариантов устойчивости к препаратам. Для левонуклеозидов, таких как LMV, и ациклических сульфатов, таких как ADV, требуется только одна мутация. Например, rtM204I вызывает устойчивость к LMV, а rtN236T — к ADV. Для ETV, представителя класса циклопентанов, требуется как минимум три мутации: rtM180L и rtM204I плюс одна из rtI169, rtS184, rtS202 и rtM250.
7. другие факторы К факторам, влияющим на противовирусную терапию, относятся прошлый лекарственный анамнез, комплаенс, генетические факторы хозяина (например, врожденные дефекты метаболизма) и способность эффективно превращать нуклеозидные аналоги в их активные метаболиты посредством ряда внутриклеточных фосфорилирований (классы восстановительных ферментов в гепатоците). Кроме того, существуют криптические участки, которые могут быть недоступны для эффективности противовирусных препаратов, а кцДНК, ключевой промежуточный продукт репликации HBV, как правило, нечувствительна к традиционным методам лечения.
В-третьих, специфические модели устойчивости к различным нуклеозидным (кислотным) препаратам
Один класс препаратов, доступных в настоящее время в Китае, — это аналоги леводезоксицитидина, включая ламивудин (LMV) и телбивудин (LdT); второй класс — ациклофосфаты, адефовир (ADV); и третий класс — препараты на основе циклопентана, включающие дезоксигуанозиновый аналог энтекавир (ETV). Их химическая классификация выделена, поскольку она может влиять на характер и пути развития устойчивости к аналогам нуклеозидов (кислот).
Варианты резистентности LMV Варианты резистентности LMV находятся на последовательности YMDD в каталитической области полимеразы HBV или известной как область C. Основные варианты резистентности, выбранные при лечении LMV, находятся в области RT, rtM204I/V/S (область C) с или без rtM180L (область B). Другие варианты устойчивости включают rt181T/V. Компенсаторные варианты встречаются в других областях полимеразы HBV, таких как rtL80V/I, rtV173L и rtT184S. Частота резистентности к ламивудину увеличивается со скоростью от 14% до 32% в год в течение курса лечения. rtM204V/I, преобладающий вариант резистентности LMV, перекрестно устойчив к LDT, но не к ADV. ADV, но не с rtA181T. Следует отметить, что rtM204V/I снижает восприимчивость к ETV.
В экспериментах in vitro связанные с LMV лекарственно-устойчивые мутации снижали восприимчивость вируса к LMV как минимум в 100 раз и даже более чем в 1000 раз. Мутации rtM204I могут присутствовать сами по себе, тогда как rtM204V и rtM204S только сопровождают другие мутации в регионах A или B. Молекулярный механизм устойчивости к ламивудину заключается в замене метионина в мотиве YMDD полимеразы на валин или изолейцин, ß-метил которого приводит к уменьшению пространства связывания трифосфата ламивудина, создавая пространственный барьер, препятствующий связыванию трифосфата ламивудина с полимеразой HBV.
Варианты резистентности LDT Тебивудин является L-энантиомером природного дезоксинуклеозида тимидина, а сайт резистентности аналогичен сайту резистентности ламивудина, оба находятся в области YMDD, причем наиболее часто встречающимся вариантом является замена rtM204I.
Варианты устойчивости к АДВ Изначально было установлено, что устойчивость к адефовиру связана с мутациями в области полимеразы В rtA181T и области D N236T. Варианты резистентности к адефовиру встречаются реже, чем резистентность к LMV, при этом частота резистентности после двух лет дозирования составляет примерно 2, трех лет — 4, четырех лет — 18 и пяти лет — до 29. rtN236T не оказывает существенного влияния на восприимчивость вируса к ламивудину, но мутантные штаммы rtA181T/V могут быть частично перекрестно устойчивы к ламивудину. Другой вариант в области обратной транскриптазы (rtI233V) также был связан с резистентностью к АДВ. Клинические исследования показали, что вариант rtI233V встречается почти у 2 из всех пациентов с ХБП, но точная роль этого варианта в неудаче лечения АДВ или отсутствии ответа на него в настоящее время неясна.
Варианты устойчивости к ETV Устойчивость к энтекавиру первоначально возникает только у пациентов, устойчивых к ламивудину, и связана с мутациями в генах вирусной полимеразы, в основном rtI169T или rtS184G в регионе B, rtS202I в регионе C и rtM250V в регионе E. В отсутствие устойчивости к ламивудину rtM250V увеличивает IC50 в 9 раз, тогда как rtT184G + rtS202I не оказывают такого эффекта. В отсутствие устойчивости к ламивудину rtM250V увеличивал IC50 в 9 раз, тогда как rtT184G + rtS202I — нет; в присутствии вариантов rtL180M и rtM204V IC50 мог быть увеличен более чем в 100 раз. Недавно сообщалось о первичных резистентных вариантах ETV у пациентов первичного звена. Частота резистентности в первый год приема энтекавира у пациентов первичной медицинской помощи очень низкая, а в течение пяти лет она составляет всего 1,3. Однако у пациентов, ранее получавших ламивудин, частота резистентности через четыре года после перехода на энтекавир достигает 40.
Механизм устойчивости к rtT184G в сочетании с вариантом rtS202I заключается в конформационном изменении, включающем изменение геометрии нуклеотид-связывающей области и изменение связывания полимеразы с шаблонной ДНК, расположенной вблизи мотива YMDD. Устойчивость к rtM250V основана на изменении связывания между нитью шаблона ДНК, нитью праймера и вновь включенным dNTP.
Проблемы, вызванные генетическим перекрытием между регионами полимеразы и S
Ген наружной мембраны вируса HBV (S-антиген) полностью перекрывается с геном полимеразы, поэтому варианты устойчивости к нуклеозидным (кислотным) препаратам могут приводить к изменениям в S-антигене. Генетическое перекрытие между полимеразой и S-антигеном важно, поскольку распространенные варианты, устойчивые к ламивудину, такие как (rtV173L+rtL180M+rtM204V), имеют важные и значительные изменения в S-антигене (sE164D+sI195M), что приводит к значительному снижению связывания с S-антителами (связанными с вакциной) в анализах in vitro. Аналогично, rtA181T может быть обнаружен отдельно или в ассоциации с rtN236T в более чем 40 случаях у пациентов, не прошедших лечение адефовиром. Варианты rtA181T в области Rt могут привести к изменению Sw172 (стоп-кодона) в антигене S, который перекрывается с ним.
Warner и Locarnini et al. обнаружили, что этот вариант HBV имеет дефектную функцию секреции и что вирусные частицы удерживаются в клетках, и что этот вариант подавляет секрецию вирусных частиц диких штаммов HBV. Клиническое значение этих исследований заключается в том, что вирусологическое определение резистентности (повышение уровня ДНК HBV по сравнению с надиром более чем на 1 logIU/ML в двух последовательных образцах, разделенных более чем одним месяцем) больше не применяется, когда этот вариант является (ко-)селективным. rtA181T появился, и вирусная нагрузка только постепенно увеличивалась от надира в течение 12-месячного периода. Поэтому генотипирование и секвенирование полимеразного региона следует проводить в дополнение к наблюдению за вирусной нагрузкой, когда пациенты находятся на противовирусной терапии.
Заключение
Устойчивость ВГВ к аналогам нуклеозидов (кислот) по сути является отбором вариантных штаммов квазивируса ВГВ под давлением лекарственной селекции. Длительный период полураспада ккДНК и продолжительная жизнь инфицированных гепатоцитов приводят к необходимости длительного лечения и наблюдения за пациентами с хроническим гепатитом В. В течение этого периода следует подбирать соответствующие препараты и схемы лечения, чтобы предотвратить или уменьшить появление устойчивых к вирусу вариантных штаммов и повысить эффективность противовирусной терапии. Сложная структура возникших лекарственно-устойчивых вариантов в полимеразной области HBV и появление многочисленных компенсаторных вариантов заставили выбрать компромиссные стратегии для последующей восстановительной терапии.
Необходимы дальнейшие исследования по правильной интерпретации вирусной нагрузки, генотипа HBV и секвенирования полимеразной области, а также существует большая потребность в доступных и более обширных интерактивных программах баз данных для информационного обеспечения восстановительной терапии. Если вирусная репликация может быть эффективно подавлена в течение длительного времени, вирусная нагрузка снизится до уровня, при котором появление новых паратипов вируса с лекарственной устойчивостью маловероятно.