Узлы щитовидной железы — одно из самых распространенных эндокринных заболеваний, из которых только 5-15% перерастают в рак щитовидной железы. Рак щитовидной железы (ЩЖ) является наиболее распространенной эндокринной злокачественной опухолью, составляя 1% всех злокачественных опухолей организма и 91,5% злокачественных опухолей головы и шеи [1]. Дифференцированная карцинома щитовидной железы (ДТЩЖ) составляет более 90% всех случаев рака щитовидной железы, включая папиллярную карциному щитовидной железы (ПТЩ) и фолликулярную карциному щитовидной железы (ФТЩ). Обследования показали, что ежегодно в мире регистрируется около 122 800 новых случаев рака щитовидной железы, причем частота встречаемости РЩЖ значительно возрастает [2]. Прогноз дифференцированной карциномы щитовидной железы тесно связан со стадией, поэтому ранняя диагностика имеет большое значение. В настоящее время для ранней диагностики рака щитовидной железы используется множество диагностических методов: УЗИ, КТ, МРТ, ПЭТ/КТ и тонкоигольная аспирационная биопсия (FNAB). Обычно тонкоигольная аспирационная биопсия с ультразвуковым наведением считается наиболее эффективным методом предоперационной диагностики рака щитовидной железы, чувствительность которого составляет 93%, а специфичность — 75% [3]. Однако у ФНАБ есть ограничения: трудно получить точную ткань поражения, если узел менее 1 см в диаметре; количество клеток или ткани ограничено; и это инвазивный тест. Только 20%-25% послеоперационных патологических находок у пациентов с неопределенным или подозреваемым злокачественным поражением являются раком щитовидной железы, и еще 75%-80% пациентов подвергаются ненужной операции на щитовидной железе [4]. Ранняя диагностика РТК с помощью неинвазивных методов всегда была актуальной и сложной клинической задачей. В последние годы во многих исследованиях предпринимались попытки улучшить раннюю диагностику ДТК путем выявления специфических изменений в экспрессии белков в сыворотке крови пациентов с ДТК для поиска маркеров опухоли ДТК, и некоторые из этих результатов показали хорошие перспективы для применения. 1. Бесцелевые протеомные исследования сыворотки крови при дифференцированном раке щитовидной железы Многие исследования обнаружили аберрантную экспрессию генов в ДТК, включая мутацию BRAFV600E, перестройку гена RET/PTC1, мутацию RAS и TRK в папиллярной карциноме [5]; мутацию NRASQ61R, мутацию BRAFK601E, PAX8/ Перестройка PPARG, мутация RAS и перестройка гена RET/PTC [6]. Эти мутировавшие гены не только вызывают аномалии в кодируемых белках, но и могут привести к изменениям в активности соответствующих сигнальных путей, прямо или косвенно влияя на трансляцию и посттрансляционную обработку модификаций связанных с путями белков. Поиск и анализ различий в опухолевых белках позволяет выявить маркеры опухолей, специфичные для ДТК. В настоящее время распространенными методами протеомики являются матрично-ассистированная лазерная десорбция/ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия (MALDI-TOF-MS), поверхностно-усиленная лазерная десорбция/ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия (SALDI-TOF-MS) и поверхностно-усиленная лазерная десорбция/ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия (SALDI-TOF-MS). масс-спектрометрии (SELDI-TOF-MS) и масс-спектрометрии с поверхностно-усиленной лазерной десорбцией/ионизацией во времени пролета (SELDI-TOF-MS). Sofiadis A[7] (2010) и Becker S[8] (2012) использовали SELDI-TOF-MS и двумерный гель-электрофорез для анализа различий в экспрессии белков между образцами тканей ДТК и контрольными образцами, соответственно, в качестве модели для диагностики ДТК. Однако различия белков в тканях не эквивалентны различиям белков в сыворотке, а количество и характер тканей, полученных для ранней диагностики опухолей, изменчивы и склонны к ложноотрицательным результатам, поэтому тканевая протеомика не подходит для ранней предоперационной диагностики. Образцов сыворотки много, и в клинической практике извлечение сыворотки происходит легко и быстро. Сывороточные белки многочисленны (60C80 мг/мл) и разнообразны (сотни видов) [9]. Lu Xubo et al [10] (2006) обнаружили уникальные различия в экспрессии сывороточных белков в каждой из трех групп рака щитовидной железы, доброкачественных узлов щитовидной железы и здоровых людей, а также то, что с помощью методов протеомики сыворотки крови можно создать модели дактилоскопии сывороточных белков с высокой специфичностью и чувствительностью. Это говорит о том, что протеомика сыворотки крови может быть более выгодной в ранней диагностике опухолей из-за ее способности анализировать различия между сыворотками опухолей и доброкачественных поражений. С момента первого сообщения об использовании технологии протеомики для скрининга сывороточно-ассоциированных белковых маркеров при раке яичников в 2002 году [11], технология протеомики широко используется для исследования многих опухолей человека, таких как рак легких [12], рак поджелудочной железы [13], рак яичников [14], рак молочной железы [15], рак толстой кишки и т.д. [16]. На сегодняшний день отечественные и зарубежные исследователи использовали протеомные подходы для изучения образцов сыворотки крови пациентов с дифференцированным раком щитовидной железы и провели скрининг некоторых потенциальных маркеров сывороточных белков или создали модели профилирования сывороточных белков с высокой специфичностью и чувствительностью для диагностики РЩЖ. 1.1 Матрично-ассистированная лазерно-разрешенная ионизация времяпролетная масс-спектрометрия (MALDI-TOF-MS) MALDI-TOF-MS — традиционная техника для разделения и идентификации белков. Он основан на использовании импульсного лазера на основе азота, который заставляет матрицу поглощать энергию лазера, тем самым ионизируя пептидный образец. Затем пептидный образец поступает в масс-анализатор, где происходит ионизация из-за разницы в соотношениях массы и заряда, и могут быть измерены соответствующие параметры пептидного иона: масс-отпечаток пептида, метка пептидной последовательности или частичная аминокислотная последовательность, и, наконец, соответствующее программное обеспечение может быть использовано для поиска в протеомной базе данных для качественной идентификации или количественного анализа белка. Andrew Martorella et al [17] (2007) использовали анализ MALDI-TOF-MS для выявления 98 значительно отличающихся пептидов сыворотки крови в 27 случаях рака щитовидной железы и 32 случаях рака щитовидной железы для формирования пептидного отпечатка сыворотки крови, и эта модель смогла определить различия между двумя группами пептидов сыворотки крови с высокой статистической точностью. Однако экспериментально обнаруженная пептидная модель не подвергалась экспериментам по слепому отбору, поэтому экспериментальные результаты еще предстоит подтвердить, а экспериментальные методы необходимо усовершенствовать. По мере развития протеомных исследований разрабатываются новые методы протеомики, такие как масс-спектрометрия с лазерной ионизацией с поверхностным усилением (SELDI-TOF-MS), которая, в отличие от MALDI-TOF-MS, позволяет использовать сырые, необработанные образцы (например, сыворотки, ткани, жидкости организма и т.д.) для крупномасштабного, ультрамикро, высокопроизводительного, полностью автоматизированного скрининга белков. Он также может использоваться в различных комбинациях белковых профилей для диагностики и изучения соответствующих заболеваний, и в настоящее время широко изучается в фундаментальной и клинической онкологии. 1.2 Масс-спектрометрия с поверхностно-усиленной лазерной ионизацией (SELDI-TOF-MS) SELDI-TOF-MS, также известная как дактилоскопия белков, состоит из белкового микрочипа, времяпролетного масс-спектрометра и программного обеспечения для анализа. В зависимости от длины полета белков с различным отношением массы к заряду в поле прибора, положение измеряемой группы белков на карте зависит от времени полета и представляется в виде пиков, которые при компьютерной обработке наносятся на карту масс-спектрометрии, непосредственно показывая молекулярную массу и содержание различных белков в образце. Сравнивая спектры экспериментальной группы со спектрами контрольной группы, можно идентифицировать и фиксировать специфические для заболевания соответствующие белки. Yuxia Fan et al [1] (2009) использовали SELDI-TOF-MS для анализа и скрининга трех дифференциальных пиков сывороточных белков у пациентов с ПТК и доброкачественными поражениями щитовидной железы: гаптоглобина a1 цепи (9190 Da), аполипопротеина C-I (6631 Da) и аполипопротеина C-III (6631 Da). Высокая экспрессия цепи гаптоглобина a1 и низкая экспрессия аполипопротеина C-I и аполипопротеина C-III были использованы в качестве диагностической модели для ПТК, с диагностической чувствительностью 98%. Специфичность составила 97%. Wang et al [18] (2006) и William H et al [19] (2008) использовали тот же метод для создания модели диагностики опухоли, состоящей из дифференциальных пиков белков. Метод SELDI-TOF-MS может точно анализировать и отсеивать белки или пептиды, которые отличаются между злокачественными и доброкачественными опухолями и нормальной сывороткой, а также обнаруживать тонкие различия между ними; в то же время сыворотку можно легко собрать и сохранить в достаточном количестве. Его можно использовать для ранней диагностики опухолей и поиска опухолеспецифических маркеров. Однако этот метод не имеет целевого белка, больших объемов измерений и плохой воспроизводимости экспериментальных результатов, что еще предстоит подтвердить. В целом, дифференциальные белки, полученные в вышеуказанных экспериментах, варьируются в широких пределах, с разной степенью чувствительности и специфичности, и такие данные не могут быть использованы в клинических приложениях. Причинами этого могут быть: 1. Уровень измерений в разных учреждениях различен. Александр [20] (2009) направил 20 высокоочищенных рекомбинантных белков человека в 27 исследовательских лабораторий протеомики на основе жидкостной хроматографии, и только 7 лабораторий правильно указали 20 белков.2. Состав и количество белков или пептидов в сыворотке находится в состоянии динамического изменения. Воспроизводимость результатов таких экспериментов плохая. Метод обнаружения различий белков в сыворотке без мишени, похоже, не работает. Фактически, протеомное исследование опухолей состоит из двух основных аспектов: (1) экспрессионная протеомика, которая фокусируется на скрининге дифференциальных белков по количеству и соотношению массы и заряда, а также на построении моделей диагностики опухолей. Функциональная протеомика направлена на изучение опухолевого генеза и развития на уровне структуры, функции и механизма действия белков. Поэтому различия в белках возникают не только из-за различий в экспрессии, но и в постсинтетических модификациях белков, включая фосфорилирование, гликозилирование и ацетилирование [21]. Среди них модификации гликозилирования являются одними из самых важных посттрансляционных модификаций белков и наиболее изучены в научных исследованиях. Гликозилирование белков — это ковалентное присоединение олигосахаридных фрагментов и боковых цепей аминокислот друг к другу с последующим сворачиванием полипептидных цепей с определенным расположением аминокислот для формирования белковых молекул с определенной пространственной структурой, что является одной из важных посттрансляционных модификаций белков. 2/3 белков в эукариотических клетках гликозилированы. Существует два основных типа гликозилирования белков: N-гликозилирование, при котором олигосахаридный фрагмент ковалентно присоединяется к боковой цепи, содержащей аспарагин (Asn), обычно происходит в белках внеклеточной среды, включая мембранные белки, секреторные белки и белки жидкостей организма; и O-гликозилирование, при котором олигосахаридный фрагмент присоединяется к боковой цепи, содержащей остатки серина (Ser) или треонина (Thr) [ 22]. Гликозилирование белков участвует в регуляции многих физиологических и патологических событий в клетках, таких как клеточный рост, миграция, дифференциация и метастазирование опухолей. Гликопротеины поверхности клеточной мембраны расположены в самом внешнем слое клетки и взаимодействуют с внутренней и внешней средой, участвуя во многих важных биологических процессах, таких как активация рецепторов и передача сигнала [23]. Две трети белков в эукариотических клетках гликозилированы, и многие рецепторы клеточной поверхности относятся к гликопротеинам, такие как EGFR, интегрины и TGFBR, которые все N-гликозилированы [21]. Arcinas [24] в 2009 году провел сравнительный анализ профилей экспрессии белков клеточной поверхности и секретируемых белков в пяти различных клеточных линиях рака щитовидной железы человека и выявил в общей сложности 333 гликозилированно-модифицированных белка. В исследовании клеточных линий дифференцированного рака щитовидной железы (TPC-1, FTC-133) пять белков — белок клеточной мембраны, ботулин, молекула клеточной адгезии-1, гликопротеин трофобласта и белковая цепь дискоидного интегрина альфа-5 — экспрессировались исключительно в DTC. Miyoshi et al [21] (2010) далее продемонстрировали, что в гликозилированно-модифицированных опухолевых клетках дифференцированного рака щитовидной железы гликозилирование-модифицирующая трансфераза FUT8 значительно повышалась на ранней стадии, а GnT-V значительно повышалась на поздней стадии экспрессии. Из приведенных выше исследований ясно, что происходит усиленное гликозилирование гистоновых белков щитовидной железы. Текущее исследование также показало, что у пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой (N-ацетилглюкозаминилтрансфераза V, GnT-V; N-ацетилглюкозаминилтрансфераза III, GnT-III; α1-6-инкорн гликозилтрансфераза, α1-6FT)[25], раком молочной железы (N-ацетилглюкозаминилтрансфераза V , GnT-V)[26] и раком предстательной железы (B-связывающий белок бусин)[27]. Хиденори [28] обнаружил экспрессию галектина-3 в сыворотках пациентов с раком щитовидной железы. В настоящее время изучение гликозилированных модификаций белков сыворотки крови при дифференцированном раке щитовидной железы менее изучено в ранней диагностике, но этот подход все еще показывает некоторые перспективы и дает новые идеи для исследований, например, несколько дифференциально гликозилированных белков DTC могут быть просеяны и объединены с более специфическим тиреоглобулином в качестве диагностической модели, поэтому необходимы дальнейшие исследования для изучения аномальных гликозилированных модификаций белков при дифференцированном раке щитовидной железы. Выводы и перспективы В целом, ранние диагностические исследования серологии дифференцированного рака щитовидной железы все еще находятся на экспериментальной стадии. Бесцелевые исследования протеомики сыворотки дают очень четкую исследовательскую идею, но протеомика сыворотки до сих пор не применялась для ранней клинической диагностики дифференцированного рака щитовидной железы по следующим причинам:1, Тщательный анализ результатов вышеуказанных серологических тестов показывает, что дифференциальные белки, полученные разными исследовательскими учреждениями, сильно отличаются, а воспроизводимость экспериментальных данных плохая, что делает клиническое применение невозможным[20].2, Сывороточные белки 99% белков сыворотки крови состоят из 22 высокомолекулярных белков, таких как альбумин, трансферрин и конъюгированный глобулин; оставшийся 1% состоит из сотен низкомолекулярных белков. Количество белков в сыворотке крови разнообразно и часто динамично [9]. Существующий традиционный подход, когда маркеры опухоли пытаются найти с помощью нецелевых исследований сыворотки/плазмы с низким содержанием малых молекулярных пептидов, похоже, не работает.3 Целенаправленное изучение измененного количества белков. Различия между нормальной и опухолевой тканью, обусловленные генетическими изменениями, отражаются в белках, но функциональные различия в белках возникают не только из-за различий в обильной экспрессии, но в большей степени в постсинтетических модификациях белков, включая фосфорилирование, гликозилирование, ацетилирование и т.д. В результате начали развиваться исследования модификаций белков при дифференцированном раке щитовидной железы, особенно гликозилированных белков, специфичных для дифференцированного рака щитовидной железы, и из приведенных выше исследований видно, что существуют усиленные гликозилированные модификации в белках клеток ткани щитовидной железы, но аномальные гликозилированные модификации белков сыворотки/плазмы крови при раке щитовидной железы менее изучены и нуждаются в дальнейшей разработке.