Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (МСКК) — это мультипотентные стволовые клетки мезенхимального происхождения, которые могут способствовать структурному и функциональному восстановлению поврежденных и стареющих органов и являются наиболее перспективными затравочными клетками для регенеративной медицины. Эффективность трансплантации БМКШ была признана, но механизм клеточной терапии все еще остается предметом дискуссий. Ниже приводится обзор последних исследований, посвященных механизму использования БМКШ в лечении ишемического инсульта.
1. влияние БМСК на перфузию мозговой крови и проницаемость гематоэнцефалического барьера
Cesario и др. пересадили мышиные БМКШ в стриатум ишемизированных крыс и обнаружили, что мозговой кровоток и проницаемость гематоэнцефалического барьера значительно улучшились, приблизившись к норме через 12 дней лечения. После 12 дней лечения мозговой кровоток был близок к нормальному. Также наблюдалась положительная дозозависимая зависимость между количеством пересаженных клеток и церебральной перфузией; BBB крыс, прошедших лечение, улучшился значительно лучше, чем у контрольной группы, и такая же дозозависимая зависимость наблюдалась для улучшения BBB. Этот результат очень похож на дозозависимую зависимость между дозой и состоянием восстановления поведения в исследовании Polgar et al. Эффективность лечения также подтверждается увеличением диаметра сосудов и количества микрососудистых ветвей в тканях мозга после лечения инсульта с помощью БМКШ по данным Chen et al. Однако неоваскуляризация требует определенного периода времени, и увеличение мозгового кровотока и улучшение BBB на ранних стадиях трансплантации нельзя объяснить неоваскуляризацией. Могут ли эти результаты быть связаны с одновременным повышением уровня нейротрофических факторов в мозге? Вопрос о том, спасали ли нейротрофические факторы, опосредованные БМСК, поврежденные, но все еще жизнеспособные сосуды хозяина, требует дальнейшего изучения.
2. теория дифференциации и замещения клеток
Рациональное решение лечения инсульта с помощью клеточной трансплантации заключается в пересадке стволовых клеток вокруг ишемизированного и поврежденного участка, их дифференциации и замещении погибших нервных клеток. Фундаментальные исследования показали, что клетки можно индуцировать к дифференцировке в клетки нейрональной линии in vitro. Однако до сих пор существуют разногласия относительно выживаемости БМКШ после интрацеребральной трансплантации и дифференцировки in vivo.
Большинство исследований пришли к выводу, что БМКШ могут дифференцироваться в клетки нейронной линии in vivo, а аутологичные БМКШ крысы Ли были обнаружены живыми и распределенными в ипсилатеральном стриатуме, гиппокампе и билатеральном неокортексе даже после 4 недель трансплантации. Около 20% и 15% клеток экспрессировали нейрональные и астроцитарные маркеры, соответственно. Однако авторы не обнаружили БМСК, экспрессирующих нейрон-специфические белки, в своих исследованиях in vitro с использованием простых сред. Ли также обнаружил тенденцию к дифференцировке пересаженных БМКШ в нейроны в коре головного мозга и гиппокампе и астроциты в мозолистом теле, предполагая, что микросреда, в которую пересаживаются аутологичные БМКШ, более благоприятна для их собственной дифференцировки. Несколько исследований показали, что трансплантированные in vivo БМСК практически не способны дифференцироваться в клетки нейрональной линии in vivo. В исследовании Кастро и др. сообщалось, что БМСК не способны дифференцироваться в нейроноподобные клетки в тканях, поврежденных мозгом. В исследовании Лу также не было обнаружено, что БМСК дифференцируются в нейроны и глиальные клетки в ЦНС хозяина. Ота наблюдал, что с иммуносупрессией или без нее клетки Охта заметил, что пересаженные клетки наблюдались в месте повреждения спинного мозга через 1-2 недели после трансплантации, но ни одна из БМКШ не экспрессировала NF, GFAP, O4 и другие нейрон-специфические белки; почти все БМКШ «исчезли» через 3 недели после трансплантации, поэтому функциональное восстановление и улучшение после трансплантации клеток может не быть функцией клеток и поврежденной ткани. Однако исчезновение пересаженных клеток, по крайней мере, говорит о том, что они вряд ли или с низкой вероятностью являются опухолеродными или тератогенными, что косвенно подтверждает безопасность трансплантации БМСК.
Сомнительно, что пересаженные клетки могут эффективно восстановить повреждение ткани, если они не дифференцируются в клетки нейрональной линии или дифференцируется только небольшой процент из них. Например, нестин экспрессируется не только в ранних тканях ЦНС, но и в других развивающихся клетках, таких как мышцы и сердечная мышца; нейрон-. специфическая энолаза (NSE) — это нейрон-специфический белок, который также может экспрессироваться ненейронными тканями, такими как клетки мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легких. Судить об этой дифференциации только на основании экспрессии специфических белков, по меньшей мере, не строго.
Ли предполагает, что аутологичные клетки должны с большей вероятностью сливаться с самоповрежденными клетками, но молекулярные механизмы слияния клеток нуждаются в дальнейшем выяснении. Анализ образцов мозга, полученных после их смерти (через 22, 63 и 6 лет после трансплантации костного мозга), показал, что пересаженные клетки были способны дифференцироваться в нейроны, астроциты и микроглию. Однако хромосомный анализ не выявил полиплоидных клеток, только Y-хромосома положительные клетки, и заключение не подтверждает феномен слияния клеток. Поэтому теория о том, что пересаженные клетки могли интегрироваться в мозг хозяина и заменить поврежденную ткань мозга для восстановления нейронных цепей, пока не имеет твердого подтверждения.
Инсульт может привести к преобразованию нейрональных стволовых клеток in situ в субвентрикулярной зоне в новые нейроны. Однако подавляющее большинство новых нейронов погибает в течение 1 недели после инсульта, а количество жизнеспособных нейронов, заменяющих погибшие нейроны, очень мало. Поэтому возможно, что трансплантация стволовых клеток в поврежденную область активирует эндогенные механизмы восстановления в мозге хозяина.
Таким образом, способность пересаженных клеток замещать поврежденные клетки хозяина ограничена и только усиливает возможность этого механизма, а не простого замещения тканей.
3. Нейропептиды и нейротрофическая теория
Нейропептиды и нейротрофические факторы являются важными компонентами передачи информации в нервной ткани, а их нейронная сигнализация и нейротрофические эффекты необходимы для восстановления поврежденных тканей мозга. В последние годы им уделяется большое внимание при изучении механизмов действия БМСК в лечении инсульта.
Нейротрофические факторы представляют собой семейство структурно родственных пептидов. BDNF и NT-3 могут вызывать рост нейритов и способствовать экспрессии ключевых ферментов для синтеза нейротрансмиттеров; NGF может ингибировать апоптоз и способствовать регенерации нейронов; GDNF может ингибировать апоптоз и способствовать регенерации нейронов. NGF может подавлять апоптоз и способствовать регенерации нейронов; GDNF может защищать нейроны и уменьшать отек мозга после черепно-мозговой травмы; HGF способствует клеточному митозу и гистоморфологическому составу.
Способность HGF увеличивать экспрессию нейротрофических факторов может быть ключом к восстановлению функции мозга после инсульта, поскольку крысиные БМСК, культивируемые in vitro до шестого поколения, продолжают экспрессировать NGF и GDNF. Способность секреции GDNF регулируется окружающим микроокружением и статусом собственного роста.
Нейротрофические факторы могут повышать устойчивость клеток хозяина, способствовать выживанию, миграции и дифференцировке эндогенных клеток-предшественников, кроме того, БМСК могут играть паракринную роль, вырабатывая большое количество полезных цитокинов.
Чжан предположил, что BDNF может также стимулировать пролиферацию олигодендроцитов, что может уменьшить воспалительный экссудат и демиелинизацию в тканях мозга, а Лу обнаружил, что пересаженные клетки содержат NGF и NT-3 при исследовании травмы спинного мозга. Исследование ИФА показало, что после трансплантации повышался уровень только GDNF, активина А, TGF-β и TGF-β2, в то время как другие факторы измерялись минимально или не измерялись вообще. может увеличивать экспрессию BDNF, не оказывая при этом никакого влияния на NGF.
На секрецию IGF-1 влияют изменения во внеклеточной сигнализации, и когда Чжан применил BMSCs для лечения церебральной ишемии, он обнаружил, что секреция IGF-1 была значительно выше в группе лечения, чем в контрольной группе.
Однако нельзя исключать, что собственные клетки мозга хозяина, особенно астроциты, активируют выделение собственного нейротрофического фактора после трансплантации клеток, поэтому также важно определить источник повышенного нейротрофического фактора, а современные данные о различных нейротрофических факторах противоречивы, и необходимы дополнительные исследования нейротрофических факторов.
BNP — это нейропептид, который, как и его аналог сердечный натрийуретический пептид, обладает сильным натрийуретическим и сосудорасширяющим действием, уменьшая отек и внутричерепное давление, тем самым улучшая церебральную перфузию. Влияние BNP на мозг можно объяснить его способностью снижать системное сосудистое сопротивление, увеличивать сердечный выброс и повышать систолическую перфузию мозга. Кроме того, BNP может увеличить реабсорбцию спинномозговой жидкости, снижая давление в венозном сплетении внутри арахноидальных гранул. Song впервые определил, что БМСК могут выделять физиологически значимые дозы BNP in vitro с помощью методов ПЦР в реальном времени и радиоиммуноанализа, и обнаружил, что пересаженные БМСК могут выделять BNP в мозге хозяина. Поэтому клетки могли оказывать эффективное воздействие до миграции и инфильтрации в ткани мозга, тем самым способствуя функциональному восстановлению травмированного мозга.
Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF): VFGF — это пептидный цитокин, участвующий в ангиогенезе и развитии, который обладает двойным эффектом — стимулирует неоваскуляризацию и способствует пролиферации нейрональных стволовых клеток, играя важную роль между ними. Chen совместно культивировали БМСК с экстрактами нормального и ишемического мозга и обнаружили, что БМСК, совместно культивированные с ишемической тканью мозга, секретировали VEGF. 10 д экстрактов ишемической ткани мозга значительно повышали секрецию VEGF БМСК. Результаты показывают, что пересаженные БМКШ могут способствовать постинсультному церебральному ангиогенезу и функциональному восстановлению.
Хемоаттрактанты: После ишемического повреждения ткани мозга высвобождаются медиаторы воспаления и цитокины, такие как IL-8, молекула внутриклеточной адгезии 1 (ICAM-1), и хемокины, такие как воспалительный белок макрофагов 1 (MIP-1) и хемотаксический белок моноцитов 1 (MCP-1). БМКК обладают характеристиками воспалительных клеток и нацелены на поврежденную ткань подобно воспалительным клеткам. БМКК избирательно мигрируют в поврежденную ткань в ответ на цитокины и оказывают терапевтический эффект через нейротрофические факторы и нейропептиды в месте повреждения.
4. влияние БМСК на межклеточные синаптические структуры и их сигнализацию
Может ли клетка стать функциональной клеточной единицей после трансплантации? Как пересаженные клетки устанавливают сигнальные связи с клетками хозяина? В литературе нет данных, подтверждающих морфологическую необходимость связи между пересаженными клетками и клетками хозяина.
В нормальной ткани мозга астроциты играют важную роль в нейропротекции, не только обеспечивая нейроны энергетическим материалом, но и формируя сеть межклеточных путей между астроцитами через gap junctions, состоящие в основном из gap junction protein 43 (Cx43), которые регулируют концентрацию калия и нейротрансмиттеров. Гао показал, что человеческие БМСК вырабатывают растворимые факторы, которые улучшают межклеточные связи между астроцитами, опосредованные gap junction, и что экспрессия Cx43 соответствует этому улучшению, и что БМСК улучшают связи между астроцитами путем повышения уровня Cx43. Ли пересадил БМСК крысам через 7 дней после ишемии и обнаружил значительное увеличение аксонального маркера GAP-43 в группе, прошедшей лечение. Исследователи предполагают, что отзывчивость глиальных клеток в ишемической зоне на трансплантат может способствовать регенерации аксонов.
Синаптические структуры являются важным средством передачи и сигнализации между клетками, а синаптофизин — это специфический полисахаридный белок в мембране синаптических везикул, который вызывает высвобождение нейротрансмиттера, передачу и обработку информации посредством связывания с Ca2+. Ванг обнаружил значительное увеличение синаптофизина в группе, обработанной БМСК, по сравнению с контрольной группой с помощью иммуногистохимии, что косвенно свидетельствует о наличии синаптогенеза.
При применении БМКШ для лечения церебральной ишемии у крыс было обнаружено значительное увеличение толщины аксонов и миелиновых оболочек в ишемизированной лимбической зоне, значительное увеличение площади мозолистого тела и количества пучков белого вещества в стриатуме, а также ремоделирование выпячиваний астроцитов и их ориентации на ишемизированную зону. Авторы пришли к выводу, что лечение инсульта с помощью БМСК способствует повышению реактивности олигодендроцитов и астроцитов, связанной с неврологическим восстановлением, улучшением и ремоделированием аксонов у крыс.
5. роль трансгенных векторов БМСК
Наокадо использовал вирус простого герпеса в качестве вектора для переноса фактора роста фибробластов-2 (bFGF-2) в БМСК и пересадил трансгенные клетки через 24 часа после инфаркта мозга у крыс, показав значительное увеличение секреции FGF-2 в леченной группе, значительное уменьшение объема инфаркта мозга у крыс и улучшение поведенческих функций. Результаты показали значительное увеличение секреции FGF-2 в группе, прошедшей лечение, значительное уменьшение размера инфаркта и более выраженное улучшение поведенческих функций.
Когда BDNF и репортерный ген GFP были перенесены в BMSCs и пересажены в животную модель повреждения спинного мозга, клетки могли не только экспрессировать BDNF на высоком уровне в организме хозяина, но и способствовать росту аксонов в месте повреждения, а трансплантаты могли увеличить секрецию NGF и NT-3 в организме хозяина.
6. Outlook
Биологическая терапия является новым средством лечения заболеваний после лекарственной терапии. Гемопоэтические стволовые клетки используются в клиническом лечении гематологических заболеваний уже более 40 лет, в то время как клиническое применение негемопоэтических стволовых клеток несколько раз колебалось. В последние годы терапия стволовыми клетками оживилась благодаря повышению осведомленности и открытию мультипотенциальных БМСК. Это показало захватывающее будущее для применения.
Многочисленные данные исследований подтвердили точную роль БМКШ в лечении церебральной ишемии, не было зарегистрировано значительной токсичности или побочных эффектов, но долгосрочная безопасность клеточной терапии все еще нуждается в дальнейшем подтверждении. В центре внимания и трудностей современных фундаментальных исследований находится механизм клеточной терапии БМСК, например: могут ли клетки выживать и пролиферировать неограниченно долгое время после трансплантации? Являются ли пересаженные клетки и их потомки функциональной клеточной популяцией in vivo? Существует ли структурная связь между пересаженными клетками и клетками хозяина? Какова функция этой структурной связи и т.д.; какие питательные факторы в конечном итоге действуют в рамках недавно продвигаемой нейротрофической теории? Кто играет главную роль в этой питательной поддержке — пересаженная клетка или хозяин? Таким образом, объективно говоря, путь в клинику для лечения церебральной ишемии с помощью БМСК все еще остается сложным, хотя и многообещающим. Нам по-прежнему необходимо больше фундаментальных и доклинических исследований для выяснения механизмов клеточной терапии.