Семенной белок 17 (Sp17)-нацеленная вакцина против опухоли рака яичников
Сонг Кун Конг Бэйхуа Сонг Кун, отделение гинекологии, больница Цилу, Шаньдунский университет
Раково-тестикулярные антигены (РТ-антигены) — это группа специфических для ткани яичка белков, которые аберрантно экспрессируются в различных опухолевых клетках и ограничены в нормальных тканях вне яичка. Недавно Sp17 был идентифицирован как член семейства антигенов CT, высокоиммуногенный аутоантиген человека, который содержит в своей структуре антигенную детерминанту цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), что делает его идеальной молекулой-мишенью для иммунотерапии опухолей. Для изучения возможности использования Sp17 в качестве молекулы-мишени для иммунотерапии рака яичников для исследования были отобраны образцы опухолей трех больных раком яичников. Экспрессия Sp17 в опухолевых образцах была обнаружена с помощью полимутазной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR) и полос на бромелаиновых агарозных гелях. Одноядерные клетки (PBMC) были выделены из периферической крови путем градиентного центрифугирования по плотности и выращены в культуральной посуде, содержащей RPMI 1640 плюс 10% фетальной бычьей сыворотки с гранулоцит-макрофагальным колониестимулирующим фактором и интерлейкином-4 (IL-4) в среде. Катионная липосома DOTAP использовалась для доставки конъюгированного белка Sp17, полученного из кишечной палочки, в ДК, превращая их в антигенпрезентирующие клетки Sp17. Свежие мононуклеарные клетки периферической крови смешивали с ДК, несущими Sp17, в соотношении 10:1 и инкубировали с IL-2, собственной сывороткой и IL-7 при 37°C. IL-2 добавляли каждые 3-4 дня, а собственные питающие клетки PBMCs и ко-протеин Sp17 — еженедельно, и Т-лимфоциты собирали для анализа на цитотоксичность после 4 циклов. Цитотоксичность Т-лимфоцитов, стимулированных антигеном Sp17, оценивали с помощью стандартного 4-часового анализа высвобождения хрома, используя в качестве клеток-мишеней трансфицированные EBV аутолимфобластоидные клеточные линии (LCL), экспрессирующие или не экспрессирующие Sp17, и аутоовариальные раковые клетки. Для изучения HLA-зависимости цитотоксического эффекта в культуральную среду были добавлены антитела против человеческого лейкоцитарного антигена-I (HLA-I) и антитела против HLA-II. Для анализа фенотипа Т-лимфоцитов и содержания в них внутриклеточных лимфокинов использовались методы проточной цитометрии.
Результаты показали, что 7 из 10 свежих образцов рака яичников были положительны на Sp17, при этом уровень экспрессии Sp17 составил 70%. Опухолевая ткань экспрессировала большое количество молекул Sp17, как и нормальная ткань яичка. Sp17-специфические Т-лимфоциты были выращены с помощью DC, доставляющих Sp17 в PBMCs, и путем сенсибилизации ко-протеином Sp17, и они были эффективны как эффекторные клетки в уничтожении собственных LCL, экспрессирующих Sp17, в анализах цитотоксичности. Лизис клеток LCL был Sp17-зависимым, а LCL, не трансфецированные геном Sp17, т.е. не экспрессирующие Sp17, не лизировались ( P0.00001). Кроме того, было обнаружено, что лизис клеток-мишеней ограничен HLA-Ⅰ, а цитотоксический эффект блокировался анти-HLA-Ⅰ моноклональными антителами, в то время как анти-HLA-Ⅱ моноклональные антитела не оказывали никакого влияния на цитотоксическую активность (P0.000001), что свидетельствует о том, что Т-лимфоциты, участвующие в цитотоксичности, являются CD8-позитивными, т.е. цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ), и предполагает наличие Sp17-специфических ЦТЛ в иммунной системе пациента. В цитотоксическом анализе опухолевые клетки погибали у всех трех пациентов, используя их собственные опухолевые клетки в качестве клеток-мишеней, и этот эффект также блокировался анти-HLA-Ⅰ антителами, но не анти-HLA-Ⅱ антителами, что еще раз указывает на присутствие Sp17-специфических CTL, связанных с HLA-Ⅰ у пациентов с Sp17-позитивными опухолями, и демонстрирует, что ко-протеин Sp17 может сенсибилизировать и распознавать. Также было продемонстрировано, что ко-протеин Sp17 может сенсибилизировать и пролиферировать CTL, которые распознают Sp17 в концентрациях и фенотипах, аналогичных Sp17 на поверхности Sp17-положительных опухолевых клеток. СМА избирательно ингибировал лизис клеток-мишеней по пути перфорина, в то время как брефельдин А ингибировал Fas-опосредованный путь апоптоза, таким образом, демонстрируя, что Sp17-специфические CTL опосредуют лизис клеток-мишеней через путь перфорина. Результаты проточной цитометрии показали, что фенотип Т-лимфоцитов, выращенных в эксперименте, был в основном CD8-позитивным, что соответствовало результатам анализа на цитотоксичность, демонстрируя, что эффекторные Т-лимфоциты были CD8-позитивными, т.е. CTL. После повторной стимуляции Т-лимфоцитов ко-протеином Sp17, метод двухцветной проточной цитометрии показал, что CTL в основном производили IFN-γ и обнаруживаемое количество IL-4, что соответствует хелперным Т-лимфоцитам 1 (Th1). цитокиновый профиль, соответствующий профилю Th1.
На основании этого исследования можно сделать вывод о целесообразности использования Sp17 в качестве молекулы-мишени для вакцин против опухолей рака яичников.