Наиболее важным активатором трипсиногена является энтерокиназа, в особых случаях самокаталитическая реакция трипсина при недостатке энтерокиназы также может активировать трипсиноген, а иногда кислоты и тканевые жидкости могут активировать трипсиноген, превращая его в трипсин, и таким образом играть определенную роль. Трипсиноген поступает в двенадцатиперстную кишку и активируется энтерокиназой в кишечной жидкости, превращаясь в трипсин. Трипсин избирательно гидролизует аргининовые и лизиновые пептидные цепи, расщепляя природные белки, денатурированные белки, волокнистые белки и муцины до пептидов или аминокислот. Благодаря своей высокой специфичности и эффективности гидролиза энтерокиназа играет важную роль в разработке генно-инженерных продуктов, например, в качестве инструментальной протеазы, играющей важную роль в специфическом расщеплении рекомбинантных слитых белков.