На долю мужских факторов приходится почти 50% причин бесплодия. На мужскую фертильность влияет множество факторов, среди которых повреждение ДНК сперматозоидов является одной из актуальных тем исследований в области репродуктивной медицины в последние годы. Исследования показали, что бесплодные мужчины с аномальными параметрами спермы имеют более высокий индекс разрушения ДНК сперматозоидов (DFI), чем фертильные мужчины, а пациенты с идиопатическим бесплодием с нормальными параметрами спермы также имеют повышенный DFI; когда DFI составляет ≥ 30%, спонтанная беременность практически невозможна; DFI стабилен и может использоваться в качестве базового предиктора мужской фертильности. В клиниках (вспомогательных репродуктивных технологий) ВРТ повреждение ДНК сперматозоидов является одним из наиболее важных факторов, влияющих на результат, и привлекает все больше внимания со стороны практикующих врачей репродуктивной медицины. Тестирование на показатели повреждения ДНК сперматозоидов (DFI) до начала ВРТ и принятие мер по получению сперматозоидов с незначительными повреждениями ДНК или без них необходимы для улучшения результатов ВРТ. Цель данной статьи — рассмотреть причины, механизмы и меры противодействия повреждению ДНК сперматозоидов, а также подчеркнуть их значение для мужского бесплодия. Тан Гуансин, отделение урологии, Китайская больница Уси I. Причины повреждения ДНК сперматозоидов Ряд факторов окружающей среды, загрязняющих веществ и медицинских мероприятий могут повлиять на целостность ДНК сперматозоидов и привести к повреждению ДНК сперматозоидов. Основные из них следующие: 1. Лекарства и радиотерапия Молодые мужчины с раком (например, лимфомой и раком яичек), как правило, имеют более низкое качество спермы и серьезные повреждения ДНК сперматозоидов. Применение химиотерапевтических препаратов, а при накоплении доз лекарств, может привести к абсолютному бесплодию, в основном из-за токсического воздействия химиотерапевтических препаратов на сперматогенные клетки яичек. Повреждение сперматогонии яичек и повреждение ДНК сперматозоидов в результате радиотерапии связано с продолжительностью лечения и дозой препаратов, получаемых пациентом. Восстановление сперматогенной функции сперматогенных клеток яичек часто происходит через 1 месяц — 1 год после лечения, и исследования показали, что повреждение ДНК сперматозоидов происходит в течение всего этого процесса.2. Воспаление репродуктивного тракта Инфекция и воспаление репродуктивного тракта за яичками (например, эпидидимит яичек, простатит) может привести к появлению лейкоцитарных сперматозоидов, усилению реакции окислительного стресса и, следовательно, к повреждению ДНК сперматозоидов.3. Высокая температура в яичках Исследования показали, что Исследование показало, что болезни, связанные с жарой, могут привести к увеличению соотношения гистонов и ихтиосперма в сперме, выбрасываемой из организма, что усугубляет повреждение ДНК сперматозоидов. Это также относится к локальному нагреванию яичек, поскольку некоторые специфические виды поведения могут повышать температуру мошонки, например, горячие ванны, сидение за компьютером и длительное вождение автомобиля, все это может привести к повреждению ДНК сперматозоидов.4. Варикоцеле Варикоцеле тесно связано с повреждением ДНК сперматозоидов, а степень повреждения связана с высоким уровнем окислительного стресса, обнаруженного в сперме пациентов с варикоцеле. Недавние исследования показали, что в сперме пациентов с бесплодием при варикоцеле обнаружено большое количество чахлых сперматозоидов с высоким уровнем реактивных продуктов кислорода, и что эти чахлые сперматозоиды связаны с повреждением ДНК. Более того, целостность ДНК сперматозоидов значительно увеличилась после лечения варикоцеле.5. Уровень гормонов Экспериментальные исследования показали, что гормональные нарушения могут привести к дефектам хроматина. По сравнению с дикими мышами, у мышей с нокаутированными гормональными рецепторами снижается уровень белка ихтиосперма в сперме, снижается уровень тестостерона, ухудшается фертильность и повышается уровень повреждения ДНК. Механизм повреждения ДНК сперматозоида (a), повреждение митохондриальной ДНК сперматозоида Митохондриальная ДНК сперматозоида представляет собой голую ДНК, лишенную защиты гистонов и ДНК-связывающих белков; в то же время ее собственная способность восстанавливать повреждения очень низка, и она чрезвычайно чувствительна к различным факторам повреждения, особенно к реактивным видам кислорода (ROS). В результате сперматозоиды особенно восприимчивы к различным формам повреждения митохондриальной ДНК во время созревания, включая делеции, мутации и полиморфный метаморфоз. Наличие высокой распространенности повреждения митохондриальной ДНК в аномальных образцах спермы, как показали некоторые исследования, указывает на его роль в мужском бесплодии. (ii) Повреждение нуклеосомной ДНК: [1] Окислительный стресс: производство ROS является физиологическим явлением в различных органах и тканях репродуктивной системы, и небольшие количества соответствующих ROS играют важную роль в физиологии спермы, способствуя капацитации сперматозоидов и реакции акросомы. Однако, когда присутствует большое количество ROS, они превышают возможности антиоксидантной системы и защитные возможности уникальной компактной структуры ядра сперматозоида, что приводит к одно- или двунитевым разрывам в ДНК сперматозоида, в результате чего происходит повреждение ДНК сперматозоида. Кроме того, поскольку мембраны сперматозоидов содержат высокую концентрацию ненасыщенных жирных кислот и низкий уровень очищающих ферментов плазматической мембраны, они подвержены перекисному окислению липидов при воздействии избытка реактивных форм кислорода, в результате чего жирные кислоты теряют свои двойные связи, что в свою очередь приводит к потере текучести мембраны сперматозоида и изменению внутренней среды, в конечном итоге приводя к мутации или разрыву ДНК ядра сперматозоида. Кроме того, матрица ДНК сперматозоидов подвержена окислительному повреждению. Сообщалось, что при воздействии на сперматозоиды экзогенных (искусственных) ROS происходит значительное увеличение числа поломок ДНК в виде разрыва всех оснований, образования участков без оснований, делеций, сшивания ДНК и хромосомной реорганизации. [2] Сборка хроматина спермы: аномальная сборка хроматина спермы приводит к одно- и двухцепочечным разрывам ДНК и повреждению ДНК в ядре спермы, основным звеном является аномальное замещение гистонов белками спермы. Во время сперматогенеза сборка хроматина требует участия эндогенной нуклеазы (топоизомеразы II) для создания и связывания разрывов ДНК, что способствует снятию торсионного напряжения и реорганизации хроматина во время замены гистонов белками сперматозоидов рыб, но также может стать причиной аномального сперматогенеза или повреждения ДНК. Нарушения в сборке хроматина, приводящие к повреждению ДНК в ядре сперматозоида, также могут быть вызваны аномальными двунитевыми разрывами ДНК, которые могут происходить естественным образом во время сперматогенеза при подготовке к рекомбинации хроматина и во время сборки хроматина. [3] Апоптоз: В процессе сперматогенеза апоптоз контролирует уровень сперматогенеза и пролиферации, приводя его в соответствие с поддерживающей способностью опорных клеток и поддерживая баланс в количестве, морфологии и функции сперматозоидов. Белок Fas на поверхности сперматогенных клеток инициирует апоптоз сперматозоидов, и в сочетании с лигандом Fas (FasL) или возбуждающими агонистами анти-Fas антител может запустить апоптотическую программу для уничтожения сперматогенных клеток. Поддерживающие клетки экспрессируют FasL, тем самым ограничивая чрезмерную пролиферацию и удаляя Fas-положительные сперматозоиды. Доля Fas-положительных сперматозоидов у фертильных мужчин низка, тогда как у мужчин с аномальными параметрами спермы доля Fas-положительных сперматозоидов достигает 50%, что говорит о том, что их апоптоз может быть аномальным, а способность очищать поврежденные ДНК сперматозоиды неадекватной [1]. Другой механизм, посредством которого аномальный апоптоз приводит к повреждению ДНК сперматозоидов, связан с фотогенерирующими протеазами. Блокирование FasL/Fas в эндогенной митохондриальной мембране приводит к активации фотогенных протеаз 8 и 9, которые проводят сигналы рецепторов фотогенных протеаз, что в свою очередь приводит к активации дезоксирибонуклеазы (фактор разрушения ДНК 40) и в конечном итоге к разрыву ДНК сперматозоида. Частота Fas-позитивности была выше в сперматозоидах со слабыми и деформированными сперматозоидами. Высокий уровень повреждения ДНК в слабых и неправильно сформированных сперматозоидах был подтвержден многочисленными исследованиями, что еще раз доказывает, что апоптоз тесно связан с повреждением ДНК сперматозоидов. Aoki и др. показали, что концентрация ихтиосперминов-1 (P1) или ихтиосперминов-2 (P2) уменьшается. Aoki и др. продемонстрировали, что повреждение ДНК сперматозоидов было значительно выше у бесплодных пациентов с пониженной концентрацией ихтиосперма-1 (P1) или ихтиосперма-2 (P2), и что повреждение ДНК сперматозоидов было значительно выше при пониженных значениях P1/P2, чем при нормальных и повышенных значениях P1/P2. Поэтому дефицит фисетина также является причиной повреждения ДНК сперматозоидов. Методы выявления повреждений ДНК сперматозоидов В настоящее время основными методами выявления повреждений ДНК сперматозоидов являются: метод Комета (Comet), опосредованное концевой трансферазой дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) концевое мечение (TUNEL), анализ структуры хроматина сперматозоидов (SCSA), девичий оранжевый тест (AOT) и трансляция разрезов in situ (NT). Они могут использоваться для выявления дефектов структуры хроматина и целостности ДНК в сперме, при этом TUNEL и Comet выявляют разрывы одной и двух нитей, SCSA — аномальную структуру хроматина, а NT — разрывы одной нити. Они еще не используются в клинической практике, и для подтверждения их полезности и значимости необходимы исследования с достаточным количеством образцов. IV. Повреждение ДНК сперматозоидов и вспомогательные репродуктивные технологии В последнее десятилетие или около того произошли прорывы в области вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), особенно с использованием интрацитоплазматической инъекции одного сперматозоида (ИКСИ), что привело к серьезному прорыву в лечении тяжелых олиго-, гипо- и мальформированных сперматозоидов. Однако большое количество исследований показало, что при ВРТ повреждение ДНК сперматозоидов влияет на частоту оплодотворения, развитие эмбриональных клеток и вероятность беременности, хотя механизмы этого явления до конца не изучены, что привело к усилению внимания к взаимосвязи между повреждением ДНК сперматозоидов и ВРТ.1. Источник спермы У пациентов с обструктивной азооспермией, подвергшихся ИКСИ, значительно более высокий DFI был обнаружен, когда сперматозоиды были извлечены из эпидидимиса и яичка. Это может быть связано с длительным удержанием сперматозоидов в закупоренных репродуктивных протоках или с неполной деполимеризацией хроматиновой ДНК сперматозоидов, которая восприимчива к повреждениям и токсическим веществам. Также было установлено, что уровень повреждения ДНК сперматозоидов в яичках пациентов с обструктивной азооспермией значительно ниже, чем у сперматозоидов, находящихся в эпидидимисе. Эрманно и др. сравнили уровень повреждения ДНК в сперме яичка и в эякулированной сперме и провели ИКСИ с ними по отдельности, показав, что уровень повреждения ДНК был значительно ниже в сперме яичка, чем в эякулированной сперме, и что уровень беременности был значительно выше в первом случае, чем во втором, хотя разница в фертильности не была значительной. Результаты показали, что уровень повреждения ДНК сперматозоидов был значительно ниже в семенниках, чем в эякулированной сперме, а частота наступления беременности была значительно выше в первых, чем во вторых, хотя разница в частоте оплодотворения не была значительной. Был сделан вывод, что ИКСИ с использованием спермы яичек является наиболее эффективным средством ВРТ у пациентов с высоким уровнем повреждения ДНК сперматозоидов. Однако Букулмез и Чжао и др. сравнили результаты ИКСИ с использованием эякулированной спермы, эпидидимальной спермы и спермы из яичек без оценки целостности ДНК сперматозоидов и не обнаружили статистических различий в частоте оплодотворения, частоте оогенеза, частоте качественных эмбрионов, частоте клинической беременности и частоте ранних абортов. Поэтому необходимы дальнейшие исследования для изучения влияния различных источников спермы и повреждения ДНК сперматозоидов на результат ИКСИ. 2. Внутриматочная инъекция Многочисленные исследования подтвердили, что повреждение ДНК сперматозоидов влияет на результат внутриматочной инъекции (ВМИ). В частности, DFI оценивался с помощью анализа структуры хроматина сперматозоидов (SCSA), и шансы на оплодотворение при ВУИ были близки к нулю, когда этот показатель превышал 30%. Кроме того, при оценке с помощью терминальной трансферазы, опосредованной конечным мечением ДУТФ (TUNEL), беременность не может наступить при DFI > 12%, а от 10% до 12% приводит к аборту. Поэтому при ВУИ оценка DFI играет более важную прогностическую роль.3. Экстракорпоральное оплодотворение При экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО) повреждение ДНК сперматозоида влияет на вероятность оплодотворения и развития бластоцисты. Кроме того, качество эмбрионов является лучшим показателем беременности при ЭКО, чем обычные параметры спермы, и существует значительная отрицательная корреляция между повреждением ДНК спермы и качеством эмбрионов. Henkel и др. сообщили о значительном снижении частоты наступления беременности при ЭКО, когда DFI составлял >36,5%, а Tomlinson и др. показали, что для успешной беременности при ЭКО необходим порог DFI в 27%. При ИКСИ, хотя повреждение ДНК сперматозоида не препятствует оплодотворению и возникновению постнуклеосомных форм, и беременность даже может быть достигнута при использовании сперматозоидов с более высоким уровнем повреждения ДНК, все же существует значительная отрицательная корреляция между повреждением ДНК и частотой оплодотворения и беременности. При проведении ИКСИ Вирро и др. обнаружили, что при DFI >30% вероятна низкая частота бластоцист и беременность не наступает. В клинических условиях процент успешного оплодотворения при ИКСИ обычно не превышает 65%-80%, возможно, из-за наличия дефектов ДНК в сперме. При проведении ИКСИ с использованием сперматозоидов с дефицитом ДНК, которые вводятся непосредственно в яйцеклетку, важно, чтобы генетический материал сперматозоида был неповрежденным, поскольку он, минуя естественный отбор, может повлиять на развитие клеток эмбриона и зародыша, а также на здоровье потомства. Поэтому перед проведением ИКСИ необходимо сначала оценить ДНК сперматозоидов.5. Методы криоконсервации Имеются многочисленные сообщения о том, что замораживание-оттаивание спермы может нарушить целостность ДНК сперматозоидов при использовании ряда методов криоконсервации спермы. Кроме того, результаты тестов на отсутствие криозащиты спермы показали, что замораживание и размораживание сперматозоидов может нарушить целостность ДНК по сравнению со свежими сперматозоидами (19±16%, p