Изучить содержание и клиническую ценность генетического тестирования на сперматогенную дисфункцию. Методы Объединив собственную клиническую практику и обзор соответствующей отечественной и зарубежной литературы за последнее десятилетие, мы провели исследование генетического тестирования пациентов со сперматогенной дисфункцией. Генетические тесты для пациентов с дисфункцией сперматогенеза включали анализ кариотипа, тестирование генов сперматогенеза, тестирование генов андрогенных рецепторов и тестирование генов муковисцидоза. Сделан вывод, что необходимое генетическое тестирование должно быть приоритетным в клиническом ведении пациентов со сперматогенными нарушениями, особенно когда для содействия зачатию используются методы вспомогательной репродукции человека.
Бесплодие — проблема мирового масштаба. По данным ВОЗ, его распространенность составляет 10-15% пар репродуктивного возраста. Среди мужских причин важное место занимают нарушения выработки спермы, на долю которых приходится от 30% до 65% причин мужского бесплодия. Она проявляется в виде азооспермии, тяжелой олигоспермии, слабых сперматозоидов, деформированных и мертвых сперматозоидов.
С развитием вспомогательных методов репродукции число пациентов, проходящих лечение мужского бесплодия с помощью искусственного оплодотворения и интрацитоплазматической инъекции одного сперматозоида, растет год от года. Это также повышает генетический риск для этих пациентов. Поэтому особенно важно обеспечить таким пациентам генетический анализ и оценку риска бесплодия до применения вспомогательных методов репродукции человека, а также пренатальный скрининг и дородовую диагностику после того, как женщина забеременеет.
Сперматогенные нарушения могут быть вызваны различными факторами, такими как возраст, тяжелые системные заболевания, тяжелое недоедание, нейроэндокринно-иммунная дисфункция, генетические дефекты и загрязнение окружающей среды (радиация, химическая токсичность и т.д.) и травмы яичек. Основные генетические причины включают аномалии числа и структуры хромосом, микроделеции Y-хромосомы, мутации в гене андрогенового рецептора и муковисцидоз.
I. Аномалии числа и структуры хромосом
Сперматогенез контролируется рядом генов, которые экспрессируются упорядоченно. Аномалии в количестве и структуре хромосом могут повлиять на функцию этих генов, что в свою очередь может повлиять на сперматогенез.
Частота нарушений хромосомного числа и структуры у пациентов с азооспермией составляет от 13% до 39%; у пациентов с тяжелой олигоспермией частота нарушений хромосомного числа и структуры колеблется от 4,9% до 13,2%, в то время как в общей популяции частота нарушений хромосомного числа и структуры составляет всего 0,5%.
Пациенты с азооспермией, вызванной аномалиями хромосомного числа и структуры, имеют маленькие яички и слабые вторичные мужские половые признаки при физическом обследовании. Большинство пациентов с олигоспермией, обусловленной аномалиями числа и структуры хромосом, имеют нормальные яички и наружные гениталии, а при физикальном обследовании — достоверные мужские вторичные половые признаки. Большинство пациентов с гипоспермией имеют нормальные яички и наружные половые органы.
1. признак Крейтцфельдта-Якоба.
Наиболее распространенным кариотипом, приводящим к азооспермии, является 47,XXY, также известный как синдром Клайнфелера, на который приходится от 10% до 50% хромосомных аномалий при азооспермии. В результате аномалии Х-хромосомы у пациента наблюдается стекловидная гиалиновая дегенерация и фиброз семенных канальцев яичек, гибель сперматогенных эпителиальных клеток и отсутствие выработки сперматозоидов. Клинически пациенты выглядят высокими, с большим количеством подкожного жира и маленькими яичками. У очень небольшого числа пациентов сперматозоиды были обнаружены в семенных канальцах, и были сообщения о том, что жены забеременели с помощью методов ИКСИ.
2. Робертсоновская транслокация.
Это может быть азооспермия или олигоспермия. Поскольку большинство хромосомных точек разрыва расположены в нетранскрибируемой области ДНК, фенотип является нормальным, так как количество функциональных генов обычно сбалансировано и может выполнять нормальные функции, несмотря на изменения в структуре хромосом. Однако во время развития половых клеток небольшое количество оснований становится свободным из-за разрыва и повторного соединения генов, что приводит к относительно несбалансированной транслокации, которая нарушает нормальный мейоз и приводит к аномальному сперматогенезу.
3. аномальная аутосомная структура
Транслокации и инверсии аутосом в основном приводят к выкидышам и рождению деформированных детей, но также сообщалось, что они могут привести к олигоспермии. Основными аутосомами, вовлеченными в процесс, являются #1, #3, #5, #6, #7, #8, #9, #10, #12, #13, #14, #15, #17, #21 и #22.
Межплечевая инверсия хромосомы 9, ранее считавшаяся полиморфным явлением, была отмечена в ряде статей с генетическим эффектом. в анализе Мишича 820 случаев азооспермии было выявлено 23 случая межплечевой инверсии хромосомы 9 (9 случаев азооспермии и 14 случаев олигоспермии). Это может быть связано с тем, что инверсии оказывают препятствующее влияние на формирование бивалентных тел во время первого мейоза.
4. аномалии Y-хромосомы
Второй наиболее распространенной хромосомной аномалией при азооспермии является делеция Yq. Инверсии, транслокации, промежуточные делеции и кольцевые хромосомы фрагментов Yq11 могут вызывать тяжелые нарушения сперматогенеза. В зависимости от размера отсутствующего фрагмента, патологически могут наблюдаться различные проявления.
Генетические последствия большого Y (≥хромосомы 18) до сих пор остаются спорными. Некоторые считают, что он не влияет на фертильность; однако действительно наблюдаются клинические случаи остановки развития эмбриона, выкидыша, мертворождения, пороков развития плода и обнаружения умственной отсталости после рождения у жен пациентов с азооспермией или олигоспермией большого Y. Некоторые ученые считают, что Big Y — это чрезмерное дублирование ДНК в гетерохроматине, которое может вызывать митотические ошибки или влиять на регуляцию генов и дифференциацию клеток, что в конечном итоге приводит к репродуктивным аномалиям. Предполагается, что в будущем генетические эффекты большого Y будут четко изучены на генетическом уровне.
Также спорным является вопрос о том, имеют ли малые Y-хромосомы (≤ хромосомы 21) какие-либо клинические генетические эффекты. Обычно считается, что это хромосомный полиморфизм, который наблюдается у нормальных людей. Однако в литературе имеются сообщения о пациентах с малым кариотипом Y, страдающих азооспермией или тяжелой олигоспермией, чьи жены имели в анамнезе неблагоприятные беременности и роды. Авторы литературы считают, что малый Y, как и большой Y, нельзя считать нормальным полиморфизмом. Нет достаточных доказательств того, нарушается ли сперматогенез у пациентов с малым Y из-за некоторой связи между гетерозиготностью Y-хромосомы и сперматогенезом или из-за наличия микроделеций AZF, которые морфологически трудно определить.
5. сексуальная инверсия
46, XX реверсия пола клинически наблюдается у пациентов с азооспермией. В настоящее время принято объяснение, что гомологичная рекомбинация и обмен хромосомами X-Y происходит во время мейоза, так как определяющая пол область (SRY) Y-хромосомы находится очень близко к предполагаемой хромосомной области (PAR), что позволяет переносить ген SRY на X-хромосому. Поскольку сперматогенный ген расположен на Yq и не перенесен на Х-хромосому, поэтому у 46, ХХ мужчин развиваются только яички, но сперматозоиды вырабатываться не могут.
6. аномальный химеризм Y-хромосомы
Азооспермия или тяжелая олигоспермия может возникать у пациентов с аномальным химеризмом Y-хромосомы вследствие частичной потери или делеции Y-хромосомы и частичной потери или делеции тестикулярных детерминант (TDF) и AZF, что приводит к неполному или отсутствию экспрессии связанных с ними генетических функций, что приводит к олигоспермии или азооспермии.
В клинической практике иногда можно столкнуться с противоречивыми отчетами о кариотипировании одного и того же пациента в разных больницах: один отчет показывает нормальные кариотипы, а другой сообщает о химеризме с высокой долей нормальных кариотипов и низкой долей аномальных кариотипов. Это не та ситуация, когда можно легко предположить, что результаты любого из отчетов неверны. Его следует анализировать в контексте клинических симптомов и признаков пациентки и других аспектов обследования, а также беременности женщины-партнера.
Микроделеции Y-хромосомы
Микроделеции Y-хромосомы встречаются в 10%-20% случаев азооспермии неизвестного происхождения и в 5%-15% случаев тяжелой олигоспермии. 1976 г. Tiepolo и др. обнаружили разрыв и делецию в Yq11 у пациентов с первичной азооспермией и предположили, что в Yq есть ген, связанный со сперматогенезом, и назвали его фактором азооспермии (AZF). Дальнейшие исследования показали, что в семье AZF в области Yq11.22 — Yq11.23 могут быть делеционные мутации в нескольких локусах, а микроделеции в любом из этих локусов могут привести к нарушениям сперматогенеза.
В прошлом выявление микроделеций Y-хромосомы ограничивалось пациентами с идиопатическим мужским бесплодием, но в последние годы было установлено, что микроделеции Y-хромосомы могут также присутствовать у пациентов с крипторхизмом, варикоцеле, двусторонним vas deferens, аномалиями половых гормонов и сирингомиелией. Поэтому у таких пациентов с азооспермией и тяжелой олигоспермией также следует проводить тестирование на микроделеции Y-хромосомы. Старайтесь избегать слепого выполнения перевязки вен сперматозоидов для улучшения параметров анализа спермы.
AZF обычно делится на 3 региона, а именно AZFa, AZFb и AZFc. В 1999 году Кент-Ферст и др. предположили наличие AZFd между AZFb и AZFc, и с тех пор последовательно был идентифицирован ряд генов-кандидатов на бесплодие. Среди них кластер генов RBM1 (RNA bingding motif 1 ) со структурными последовательностями РНК и DAZ (Deleted in azoospermia), которые, как считается, играют важную роль в сперматогенезе.
Чжоу Зуомин и др. обнаружили, что частота делеции DAZ составила 18,2% и 31,6% у пациентов с азооспермией и тяжелой олигоспермией, соответственно. DAZ кодирует РНК-связывающий белок, необходимый для сперматогенеза, и дефекты в DAZ могут влиять на сперматогенез.
Ген DAZ был выделен в 1995 году, является уникальным для людей и орангутангов и высокоспецифично экспрессируется в семенниках. Это специфический ген в кластере неспецифических генов на Y-хромосоме, имеет несколько копий и гомологичен аутосомам. Кроме того, DAZ является членом полигенетического семейства, в котором ген SPGY или DAZL на аутосомах расположен на хромосоме 3.
Делеции AZFa встречаются нечасто и могут приводить к задержке сперматогенеза у подростков, проявляясь в виде патологического «синдрома только опорных клеток» и микротезиса;
Делеция AZFb встречается чаще и проявляется нормальными премейотическими эпителиальными клетками и отсутствием постмейотических клеток, что свидетельствует о нарушении сперматогенеза во время пре- или постмейотического полового созревания; делеция AZFc встречается часто и составляет около 60% микроделеций Y-хромосомы.
Патологические гистологические изменения и клиническая картина пациентов разнообразны и могут быть представлены азооспермией, олигоспермией или нормальной концентрацией сперматозоидов, но аномальной морфологией. Патология яичек выявляет ряд пустых варикоцеле, окруженных рядом варикоцеле со сперматогониями и сперматоцитами, и сниженный сперматогенез.
Хотя Y-хромосома у большинства пациентов с первичной азооспермией и тяжелой олигоспермией в основном интактна, а люди с делецией AZF не всегда бесплодны, тест на микроделецию AZF Y-хромосомы стал важным техническим инструментом и рутинным тестом для диагностики генетического мужского бесплодия.
В Китае, где в последние годы растет число консультаций по поводу мужского бесплодия и широко используются методы вспомогательной репродукции человека, особенно важно проводить тестирование на делеции AZF. Перед проведением ИКСИ пациентам с делецией AZF важно проинформировать их о риске получения потомства мужского пола с такой же делецией, чтобы избежать споров между врачами и пациентами.
Частичные делеции в области AZFc могут вертикально передаваться потомству при вспомогательной репродукции человека, и следующее поколение мужчин с частичными делециями в области AZFc идентично по типу, длине и количеству копий ДНК отцу.
Хромосомная аномалия сопровождается микроделецией Y-хромосомы. Оба этих фактора являются важными генетическими факторами, которые способствуют развитию азооспермии и олигоспермии. Одновременное тестирование этих двух показателей дает более полную картину наличия генетических дефектов нарушений сперматогенеза при мужском бесплодии.
Случай 1: Пациент с азооспермией, который наблюдался в клинике по лечению бесплодия. Его жена прошла курс лечения овуляции, и в день извлечения яйцеклетки ему была проведена чрескожная аспирация яичек для извлечения спермы, но ни один сперматозоид не был извлечен.
Двусторонняя биопсия яичек также не обнаружила зрелых сперматозоидов, и цикл лечения пришлось отменить. Позже был проведен тест на микроделецию Y-хромосомы, и было обнаружено отсутствие всего AZFb. Если бы тест на микроделецию Y-хромосомы был сделан заранее, его жене не пришлось бы переживать ненужную боль и огромные расходы.
Случай 2: Центр репродукции провел ИКСИ в трех случаях азооспермии и тяжелой олигоспермии, в результате чего родилось четыре мальчика. Этот тест не был проведен из-за отсутствия предварительной осведомленности о важности тестирования на микроделеции Y-хромосомы. Позже, с целью сбора данных для исследования, был проведен тест на микроделецию Y-хромосомы у отца и сына, который показал, что у всех четырех мальчиков и их отцов были делеции AZFc. Это позволило предположить, что делеция AZFc у отца может передаваться потомству мужского пола.
Приведенный выше случай иллюстрирует, что ИКСИ небезопасен без предварительного тестирования на микроделецию Y-хромосомы.
Аномалии генов рецепторов андрогенов
Дефекты гена рецептора андрогенов (AR) вызывают синдром тестикулярной феминизации, также известный как синдром нечувствительности к андрогенам. У пациентов с полной тестикулярной феминизацией наблюдается женское эктодермальное размножение, гинекомастия, отсутствие слепого влагалища, матки и яичников, яички в брюшной или паховой полости, бесплодие, но с кариотипом 46,XY.
Ген AR расположен в Xq11-Xq13 и кодирует белок с тремя функциональными областями. N-концевая область, выполняющая регуляторную функцию, кодируется экзоном 1; ДНК-связывающая область кодируется экзонами 2,3. Андроген-связывающая область кодируется пятью экзонами.
Было выявлено более 300 различных мутаций, в основном в ДНК-связывающей и андроген-связывающей областях. Примечательно, что в N-концевой области в экзоне 1 имеется повторяющаяся последовательность CAG. При >40 раз в этой последовательности у пациентов наблюдается спинальная демиелинизация с азооспермией и атрофией яичек; количество CAG-повторов коррелирует со сперматогенной функцией у китайцев и американцев.
IV. Муковисцидоз (МВ)
МВ распространен в популяциях европейского происхождения. Ген МВ расположен на 7q31. 70% из более чем 800 мутаций МВ, выявленных на сегодняшний день, являются делециями SF508.