В течение более 10 лет методы диагностики туберкулеза разрабатывались во всем мире, и некоторые новые методы были одобрены для использования в США, Европе и других развитых странах. Для страны с высоким бременем туберкулеза, такой как Китай, выявление пациентов в основном с помощью обычных методов бактериологического исследования может пропустить многих пациентов с активным туберкулезом, что приведет к распространению туберкулеза и усугубит опасность для общества. Я остановлюсь на потребности общества в новых методах диагностики туберкулеза, на состоянии обычно используемых тестов и нескольких перспективных тестов, а также рассмотрю перспективные методы диагностики, которые могут быть использованы.
I. Потребность в новых методах диагностики туберкулеза
В отсутствие действительно эффективной противотуберкулезной вакцины лечение бациллярно-положительного туберкулеза остается наиболее важным компонентом программ борьбы с туберкулезом. Быстрая и точная диагностика является необходимостью, и как в развитых, так и в отсталых странах быстрые и более точные методы диагностики туберкулеза, чем обычные методы, являются неизбежной тенденцией для контроля активного туберкулеза.
Во многих местах значение мазка мокроты для обнаружения Mycobacterium avium complex, растущих в мокроте пациентов, постепенно снизилось, и диагноз туберкулеза является лишь возможным диагнозом, в сочетании с наличием кашля и аномальных рентгеновских снимков грудной клетки у пожилых людей, или если пациент ВИЧ-инфицирован, диагноз туберкулеза устанавливается. Это привело к снижению специфичности мазков мокроты в диагностике туберкулеза, в некоторых случаях даже до 50%. По клиническому опыту, тест с 50% чувствительностью и 95% специфичностью имеет гораздо большую ценность, чем тест с такой же чувствительностью, но только 50% специфичностью. В первом тесте достоверность 10% амбулаторного диагноза составила 53%, и наоборот, во втором тесте достоверность составила только 10%, а ценность исключения диагноза — 94% и 50% соответственно.
С другой стороны, тест, который может быстро отличить, например, Mycobacterium tuberculosis от Mycobacterium avium complex, с помощью такого устройства позволяет избежать ненужных контактов с пациентами в начале работы отдела здравоохранения для выявления бактериологически положительных пациентов и может распределить ограниченные ресурсы для использования там, где они более необходимы. В США и других странах широкое использование тестов амплификации нуклеиновых кислот получило определенное развитие, хотя эти тесты еще не валидированы, а устройства еще не приняты окончательно.
Отсутствие быстрых и точных диагностических тестов на туберкулез привело к значительным расходам на изоляцию пациентов и ненужному эмпирическому лечению. Кроме того, такое лечение может увеличить расходы, вызывая побочные эффекты лекарств.
В бедных странах основное внимание уделяется диагностике и лечению бациллярно-положительных больных туберкулезом, в основном по следующим причинам.
Во-первых, из-за высокой стоимости культура микобактерий не является широко доступной во многих частях мира, и диагностика в основном полагается на клиническую картину, рентген и мазок мокроты. Во-вторых, позитивность мокроты указывает на высокую вероятность инфицирования, и лечение таких пациентов имеет большое значение для уменьшения источника инфекции. В силу этих условий, это, конечно, единственный путь, но мокротоотрицательных пациентов также необходимо лечить, поскольку, во-первых, особенно в бедных странах, огромное количество больных туберкулезом являются бациллоотрицательными, и по вышеуказанным причинам этим пациентам, несомненно, будет поставлен неправильный диагноз, что приведет к тяжелому течению заболевания (которое может вызвать необратимые повреждения, такие как потеря функции легких).
Во-вторых, несмотря на то, что большинство случаев передачи ТБ в популяции приходится на лиц с положительной мокротой, недавний анализ с использованием исследований полиморфизма длины участка эндонуклеазы рестрикции (RFLP) показал, что пациенты с отрицательной мокротой также являются инфекционными, а не неинфекционными, как считалось ранее, и что инфекционность увеличивается с ростом числа бациллоотрицательных случаев. Таким образом, точная диагностика у лиц с положительной мокротой — это ценный расход, как для отдельных людей, так и для групп больных ТБ.
Как в странах с ограниченными ресурсами, так и в богатых странах клинические признаки (в основном симптомы и рентгенологическая картина пациента) могут повысить частоту диагностики ТБ на 50% и более, и они могут помочь в выявлении подозрительных пациентов и проведении рутинных диагностических тестов, однако ясно, что одни лишь клинические признаки не могут служить надежной основой для диагностики ТБ.
Во-вторых, новые диагностические тесты на туберкулез
1. Диагностические тесты для активного туберкулеза
Системы быстрого культивирования Mycobacterium bifidum: В частности, например, BACTEC, MGIT, MB/BacT, Septi-check и ESP, при сочетании этих серий жидких сред с ДНК-зондами для быстрого выявления микобактерий, большинство образцов мокроты с положительным мазком могут дать положительный результат через 2 недели или менее, а образцы с отрицательным мазком — менее чем через 3 недели. Поскольку этот метод является единственным широко распространенным и может использоваться для тестирования на чувствительность к лекарственным препаратам, его ценность незаменима.
Тесты амплификации нуклеиновых кислот: В США широко используются 2 метода амплификации нуклеиновых кислот: MTD (Genprobe) и AmPlicor (Roche). MTD используется в основном в случаях отрицательного анализа мокроты, но с высоким клиническим подозрением на туберкулез. Он обеспечивает постоянную температурную среду для амплификации нуклеиновых кислот, а прибор AmPlicor применяет технологию ПЦР для размножения уникальных целевых нуклеиновых кислот, которые могут быть использованы для идентификации Mycobacterium tuberculosis в клинических образцах. Хотя целевые нуклеиновые кислоты, которые размножаются, различаются, опубликованные работы показывают, что клиническая роль этой серии экспериментов в основном одинакова. Они почти всегда обеспечивают правильный диагноз в случаях, положительных по мазку мокроты, и имеют 50%-ную частоту подтверждения в случаях, отрицательных по мазку мокроты, но положительных по культуре. Исходя из его преимуществ, Управление по контролю за продуктами и лекарствами США с самого начала использовало его для выявления положительной мокроты в клинически подозрительных случаях.
Основываясь на быстрой диагностике туберкулеза с помощью теста NAA, Американское торакальное общество недавно задало вопрос: Где лучше всего использовать NAA? В последовательно опубликованных работах, посвященных NAA-тестам, утверждается, что они могут выявить туберкулез практически полностью, ссылаясь на те случаи, которые достоверно положительны в мокроте. В то же время в этих работах говорится: этот метод следует продвигать, и он может быть более точным, чем существующие методы диагностики ТБ.
В недавнем эксперименте NAA сравнивали с обычным мазком мокроты и культурой, и их специфичность была довольно высокой, но их чувствительность была не совсем одинаковой, 50% для мазка и 100% для культуры, хотя чувствительность NAA была на уровне 80-84%, было неоднократно продемонстрировано, что она может выявить все бациллярно-положительные случаи и диагностировать половину мазок-отрицательных, но культурно-положительных случаев. Таким образом, объединяя все случаи (истинно положительные и отрицательные результаты), NAA гораздо более чувствителен, чем мазок, и лишь немного менее чувствителен, чем культура. В некоторых новых экспериментах сообщается, что NAA также уникален в диагностике мазок-отрицательного туберкулеза. Другими словами, если кто-то спросит: «Могу ли я выявить активный туберкулез у своего пациента с помощью NAA?».
то ответ, вероятно, будет точным на 92-95%, в то время как точность мазка составляет всего 80% (с оговоркой, что пациент первичный, и если пациент проходит повторное лечение, то NAA будет менее точным). Фактически, если стоимость теста ниже, NAA можно использовать вместо мазка мокроты для диагностики первичного ТБ. Конечно, его специфичность должна быть равна или выше, чем у метода мазка мокроты (AFB), применяемого в настоящее время во многих областях. В настоящее время из-за своей высокой стоимости ($50-$100 за тест) NAA относительно экономичен только в крупных центральных лабораториях, где большое количество образцов может быть протестировано быстро и легко одновременно. Есть также сообщения о том, что NAA может использоваться в бедных странах, если его цена будет скорректирована до определенного уровня.
Центры по контролю и профилактике заболеваний США (CDC) рекомендуют NAA для диагностики активного туберкулеза и рекомендуют проводить AFB-мазок и NAA при первом сборе мокроты.
① Если оба анализа положительны, диагноз туберкулеза практически подтвержден.
②Если мазок на АФБ положительный, а НАА отрицательный, рекомендуется использовать ингибитор для подавления возможного распада Mycobacterium tuberculosis в образце, а затем повторить тест.
③Если мазок на АФБ отрицательный на NAA, CDC рекомендует отправлять образец чаще, и если мазок на АФБ окажется положительным, диагноз пациента подтверждается.
④ Если и мазок на АФБ, и NAA отрицательны, следует провести дополнительный анализ на NAA, и если он по-прежнему отрицателен, диагноз туберкулеза можно исключить. Также предлагается, чтобы клинические работники не игнорировали соответствующую клиническую базу, поскольку окончательный диагноз все еще зависит от эффективности и результатов культуры.
Из этого следует, что рациональное использование НАА для быстрой диагностики ТБ должно руководствоваться следующими принципами: NAA можно использовать для дальнейшего подтверждения диагноза у тех, у кого мазок на АФБ положительный. Если мазок на АФБ отрицательный, а клинический диагноз очень подозрительный, необходимо взять образец мокроты строго для анализа на NAA, причем это должна быть либо глубоко откашливаемая мокрота, либо мокрота, стимулированная индукцией кашля. Хотя с помощью этого метода нельзя поставить быстрый диагноз более чем в 50% случаев с отрицательными мазками на АФБ, но положительными культурами, в случаях с отрицательными мазками на АФБ наблюдается достаточно высокий процент быстрой диагностики. Возможность применения этого метода была подтверждена FDA в ходе испытания MTD-2, и NAA не может использоваться в случаях, когда мазок на АФБ отрицательный, а диагноз туберкулеза не является клинически адекватным.
В прошлом роль исследования мазка мокроты заключалась главным образом в определении того, заразен ли пациент, и анализе эффективности, но нет информации о том, обладает ли NAA такой способностью. Хотя утверждается, что отрицательный NAA на нескольких различных образцах может в значительной степени исключить туберкулез, до сих пор нет данных о том, сколько раз следует провести отрицательный NAA, чтобы полностью исключить диагноз туберкулеза. Кроме того, диагностическая ценность NAA при туберкулезе неубедительна.
Например, если образец спинномозговой жидкости (CSF) положителен на NAA, можно предположить, что у пациента туберкулезный менингит, но для тех случаев, которые в основном соответствуют клиническим диагностическим критериям, даже отрицательный NAA не может исключить диагноз, поэтому в настоящее время серия экспериментов с NAA все еще не может заменить статус культуры образцов.
2, быстрое определение лекарственной устойчивости
Во многих частях мира туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью стал серьезной проблемой, поэтому быстрые эксперименты по определению лекарственной чувствительности имеют большое значение для лечения и контроля туберкулеза. В большинстве случаев обнаружения устойчивости к рифампицину достаточно, чтобы указать на необходимость перехода на препарат второго ряда против туберкулеза. Для этого проводится тестирование реальной популяции на устойчивость к препарату (наблюдение за выживаемостью организма в среде рифампицина). Один из таких методов, называемый «нематический анализ», который определяет резистентные организмы путем обнаружения изменений в гене rpoB, связанных с лекарственной устойчивостью, принес значительную коммерческую прибыль в Европе.
Этот метод особенно популярен в таких местах, как Россия, где имеется большое количество мультирезистентных больных туберкулезом, и в местах, где первичная лекарственная устойчивость является серьезной проблемой. Однако до сих пор он не использовался клинически из-за своей высокой стоимости (по крайней мере, эквивалент одного теста NAA на один тест).
Анализ сообщения гена люциферазы: В этом эксперименте образец (например, мокрота) помещается в культуральную среду и смешивается с фагом Mycobacterium tuberculosis, содержащим люциферазу, после полудня, и если в мокроте есть выжившие Mycobacterium tuberculosis, они попадают в фаг, в это время ген люциферазы начинает работать и превращается в свободный люциферин, излучающий видимый свет. Затем эти образцы, содержащие Mycobacterium tuberculosis, помещаются в среду, содержащую противотуберкулезные препараты, и готовы к тестированию на чувствительность к лекарствам.
Хотя тест изначально был впечатляющим, его клинический прогресс был медленным. Исследователи изо всех сил пытались найти технически простой и экономичный метод, который можно было бы использовать в экономически неблагополучных странах. Современной версией этого теста является BronxBox, который использует искусственную флуоресцентную пленку для отображения и записи результатов теста и способен обнаружить живые Mycobacterium tuberculosis в течение 2 дней.
Молекулярная сигнализация: Опубликован метод обнаружения Mycobacterium tuberculosis с использованием технологии молекулярной сигнализации с помощью молекул, которые светятся во время специфических химических реакций, происходящих, когда праймеры с уникальной ДНК сворачиваются в целевые фрагменты в реакции ПЦР. Таким образом, можно проводить точную и быструю диагностику с высокой точностью и специфичностью, и это может быть использовано не только для диагностики туберкулеза, но и для быстрого определения устойчивости к антибиотикам, однако молекулярный сигнал требует дорогостоящего оборудования, поэтому он не является широко доступным. Однако в будущем ПЦР для выявления этих инфекционных заболеваний разрабатывается и совершенствуется клиническими лабораториями, и молекулярные сигналы будут использоваться все шире и шире.
3. Выявление латентного туберкулеза
В последних рекомендациях по выявлению латентной туберкулезной инфекции основное внимание уделяется выбору объектов тестирования, при этом рассматриваются только те пациенты, которые, скорее всего, будут положительными, а другой метод более точного определения латентной инфекции (без перекрестной реактивности с БЦЖ или НТМ) будет в значительной степени способствовать достижению этой стратегической цели.
Изучение выработки интерферона мононуклеарными клетками периферической крови: В ответ на стимуляцию M. tuberculosis эти CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты вырабатывают гамма-интерферон, который обладает противовоспалительным действием. Недавно были предприняты попытки использовать эти иммунные реакции для диагностики инфекции M. tuberculosis. Изолированные мононуклеарные клетки периферической крови пациентов с установленным туберкулезом используются для синтеза PPD, а γ-интерферон, стимулированный этими клетками, может быть просто определен с помощью ИФА. В нескольких исследованиях сообщалось, что этот метод может точно выявить латентную туберкулезную инфекцию без необходимости последующего наблюдения за пациентом для получения результатов теста по сравнению с традиционным кожным тестом, но он более сложен технически и дорог.
Диагностика латентной ТБ-инфекции была ограничена из-за отсутствия золотого стандарта. Первоначально тест с использованием γ-интерферона, вырабатываемого при стимуляции туберкулином, проводился на людях, у которых, вероятно, была латентная ТБ-инфекция, и чувствительность этого метода составила 90%, а специфичность — 98% при анализе результатов кожного теста. Также было показано, что этот метод позволяет отличить истинно инфицированных от тех, кто вакцинирован БЦЖ, а также продемонстрировал определенную способность различать микобактерии туберкулеза и нетуберкулезные микобактериальные инфекции.
Специфичность ИФН может быть также повышена путем стимуляции клеток ранним «6-антигеном (ESAT-6)», который является продуктом микобактерий, включая БЦЖ, и может быть использован для дифференциации между Mycobacterium tuberculosis и другими микобактериями.
Однако целесообразность и работоспособность ИФН для диагностики латентного туберкулеза все еще остается под вопросом, поскольку его необходимо сравнить с ТСТ и ТФН в районах с высокой распространенностью туберкулеза, чтобы увидеть, какой тест более точен в прогнозировании прогрессирования активного заболевания.
III. Заключение
Хотя разработано много новых методов диагностики туберкулеза, которые превосходят метод мазка на АФБ по чувствительности, специфичности и статистической точности, только один анализ на амплификацию нуклеиновых кислот (NAA) получил реальное распространение. Хотя эти новые методы представляют собой огромное улучшение точности по сравнению с методом мазка АФБ и более экономичны по времени, чем культура микобактерий, более высокие инвестиции и требования к оборудованию значительно ограничивают клиническое применение, а быстрое тестирование на чувствительность к лекарственным препаратам возможно для клинического применения и в лаборатории. Однако следует еще раз отметить, что ни один из этих новых методов пока не может точно оценить инфекцию пациента и выявить эффект лечения, как два используемых в настоящее время метода исследования мазка на АФБ.
Разработка новых методов тестирования на туберкулез сталкивается с огромными трудностями, и из-за высоких затрат их трудно внедрить даже в относительно богатых странах, не говоря уже о бедных. Поэтому в будущем новые методы диагностики латентной инфекции и активного ТБ должны быть не только клинически полезными, но и экономически эффективными.