Рак печени является одним из наиболее распространенных видов рака, а заболеваемость и смертность от рака печени в Китае самая высокая в мире, на его долю приходится 55% новых случаев и смертей в мире ежегодно, из которых более 80% приходится на гепатоцеллюлярную карциному (ГЦК). p53 известен как «молекулярный полицейский», и его основные биологические функции заключаются в поддержании стабильности клеточного генома, негативно Он регулирует рост клеток и индуцирует апоптоз. Исследования показали, что не менее 50% злокачественных опухолей человека имеют изменения в гене р53. С углублением понимания патогенеза гепатоцеллюлярной карциномы появляется все больше доказательств того, что р53 тесно связан с процессом гепатоканцерогенеза. В этой статье мы рассмотрим методы экспрессии и обнаружения р53 в гепатоцеллюлярной карциноме, а также связь между р53 и клиническими особенностями гепатоцеллюлярной карциномы и прогресс генной терапии. Пан Сяопин, отделение интервенционной сосудистой хирургии, Народная больница Ухай 1 Экспрессия р53 в гепатоцеллюлярной карциноме В нормальной популяции и при доброкачественных заболеваниях антитела к р53 обнаруживаются редко, в то время как антитела к р53 в сыворотке крови обнаруживаются у большинства пациентов со злокачественными опухолями, и процент положительных результатов составляет около 7%-63%. Мутации в гене р53 присутствуют более чем в 50% гепатоцеллюлярных карцином, а мутации и делеции гена р53 обнаруживаются в 36% прогрессирующих гепатоцеллюлярных карцином, поэтому считается, что этот ген связан с гепатоцеллюлярной карциномой. Gong Ling и др. исследовали экспрессию р53 в 40 тканях гепатоцеллюлярного рака печени, ассоциированного с гепатитом В, и соответствующих паранеопластических тканях. Результаты показали, что положительная экспрессия белка Р53 была значительно выше в тканях гепатоцеллюлярной карциномы, чем в паранеопластических тканях печени (Р=0,047). Ren Yong и др. исследовали экспрессию белка Р53 в 49 тканях ГЦК, 21 паранеопластической ткани и 10 нормальных тканях печени, и результаты показали, что 53,1% тканей ГЦК имели положительную экспрессию белка Р53. Положительная экспрессия белка Р53 в паранеопластических тканях составила 9,5%. Разница между этими двумя показателями была значительной (P<0,01). В 10 случаях в нормальных тканях печени экспрессия белка Р53 отсутствовала. Yu Hong et al. собрали 62 случая первичных тканей рака печени и соответствующих паранеопластических тканей, определили экспрессию р53 и провели наблюдение. Результаты показали, что экспрессия р53 в раковых тканях была значительно выше, чем в паранеопластических тканях, и положительно коррелировала со степенью дифференцировки опухоли (P<0,05); не было различий между экспрессией р53 и полом, возрастом и размером опухоли. Zhang Zhipei и др. собрали 42 случая парафиновых тканей ГЦК и определили экспрессию мутантного р53 в тканях ГЦК, анализ показал, что положительная экспрессия мутантного р53 была в основном локализована в ядре, а положительная частота мутантного р53 в тканях ГЦК составила 47. 62%. Положительный уровень антител к р53 в тканях ГЦК широко варьировался в разных исследованиях, и Гуань Юнсун и др. предположили, что он может быть связан с расой и стадией опухоли пациентов, включенных в исследование, а также с местом и типом мутации р53. Однако сверхэкспрессия белка р53 в тканях ГЦК несомненна, и р53 можно использовать как важный индикатор, позволяющий реагировать на биологическое поведение ГЦК. 2 Методы выявления р53 в гепатоцеллюлярной карциноме Обычно секвенирование гена р53 в опухолевых тканях или выявление мутировавшего белка р53 в опухолевых клетках методом иммуногистохимии является золотым стандартом для выявления наличия мутации гена р53 в опухолях. Продукт онкогена р53 дикого типа, белок р53, имеет короткий период полураспада (1-2 часа) и остается на низком уровне в нормальных клетках, что затрудняет его обнаружение; в то время как продукт белка р53, экспрессируемый мутировавшим геном р53, может быть обнаружен с помощью иммуногистохимии из-за его длительного периода полураспада (2-12 часов), которая наиболее широко используется в клинической практике для обнаружения мутаций гена р53 на уровне белка. Chen Ke-he и др. использовали технологию олигонуклеотидного микрочипа для определения частоты и формы мутаций в семи распространенных сайтах мутации гена р53 в гепатоцеллюлярной карциноме в Китае, результаты были подтверждены секвенированием ДНК. Было обнаружено 54 образца гепатоцеллюлярной карциномы с парафиновыми вставками, частота мутаций гена р53 составила 38,9% (21/54). Мутации р53 в основном происходили в 249 кодирующей области; результаты были подтверждены секвенированием ДНК, и совпадение между двумя методами составило 100%. FASAY обладает более высокой чувствительностью для выявления мутаций р53 по сравнению с иммуногистохимическим анализом. Метод FASAY - это метод аллельного функционального анализа для выявления мутаций р53 на уровне РНК. Ву Сяомоу и др. использовали этот метод в сочетании с секвенированием ДНК для выявления структурных мутаций в гене р53 и функции белка р53 в 28 клинических первичных хирургических образцах гепатоцеллюлярной карциномы. Положительные результаты анализа FASAY были обнаружены в 15 случаях, при этом частота мутаций гена р53 составила 53,6%. Секвенирование кДНК этих 15 положительных образцов выявило мутации гена р53, в то время как в 13 отрицательных образцах FASAY мутаций гена обнаружено не было. Полученные результаты свидетельствуют о том, что FASAY является чувствительным методом для выявления структурных и функциональных мутаций в гене р53 при ГЦК. Во многих исследованиях была обнаружена значительная корреляция между наличием антител к Р53 и накоплением белка Р53 и мутаций р53, так что о наличии мутаций р53 можно судить и по относительно простому определению статуса антител к Р53 в сыворотке крови. Авторы считают, что метод FASAY может быть использован для широкомасштабного скрининга мутаций р53 в ГЦК и изучения их транскрипционной активности, что в конечном итоге будет способствовать диагностике, прогнозу и лечению пациентов с опухолями ГЦК. Анализ на антитела к р53 в сыворотке крови удобен, точен и специфичен, и может применяться в клинической практике в качестве вспомогательной диагностики. 3 Связь между р53 и клиническими характеристиками гепатоцеллюлярной карциномы Guan Yongsong et al. использовали ИФА для количественной оценки корреляции между антителом Р53 в сыворотке крови и полом, возрастом, историей употребления алкоголя, HbsAg, баллом KPS, патологическим диагнозом, степенью дифференцировки опухоли, циррозом, характером роста опухоли, стадией опухоли, инвазией сосудов, наличием внепеченочных метастазов, классификацией Чайлда, сывороточным альбумином, АФП, сывороточным ферритином Была обнаружена корреляция. Был сделан вывод, что положительное сывороточное антитело Р53 было связано с низкой дифференцировкой опухоли (P = 0,020), внепеченочным метастазированием (P = 0,002), поздней стадией опухоли (P = 0,027), сосудистой инвазией и другими показателями, представляющими плохие биологические характеристики опухоли. Аналогично предыдущему исследованию. 3.1 Взаимосвязь между р53 и степенью дифференцировки опухоли и стадией опухоли Guan Yongsong et al. пришли к выводу, что у пациентов с низкой патологической дифференцировкой уровень позитивности антител к Р53 составил 66,7%, что было значительно выше, чем у пациентов с высокой (25,0%) и промежуточной (15,4%) дифференцировкой. Уровень позитивности антител к Р53 был выше у пациентов с поздней стадией опухоли, чем у пациентов с ранней стадией. Эти результаты позволяют предположить, что пациенты с положительными антителами к Р53 в сыворотке крови имеют плохо дифференцированные опухоли, позднюю стадию и высокую степень злокачественности. Основные исследования также показали, что частота мутаций гена р53 была выше при плохо дифференцированной гепатоцеллюлярной карциноме, а мутации гена р53 чаще встречались на поздних стадиях опухоли, чем на ранних. Gong Ling et al. пришли к выводу, что уровень положительной экспрессии р53 был значительно выше в тканях плохо дифференцированной гепатоцеллюлярной карциномы, чем в тканях с высокой и средней дифференцировкой (P=0,017). Многофакторный анализ модели пропорционального риска Кокса показал, что клиническая стадия (P=0,028) является независимым прогностическим фактором. 3.2 Взаимосвязь между р53 и сосудистой сетью опухоли Эксперименты Вольперта и др. подтвердили, что мутация р53 увеличивала экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и значительно снижала супрессор ангиогенеза (TSP), предполагая, что мутация р53 играет важную роль в ангиогенезе опухоли. Исследование Рен Йонга также показало, что мутация р53 была одной из причин высокой экспрессии VEGF. Как видно, ангиогенез опухолей ГЦК тесно связан с их метастазированием и зависит от экспрессии VEGF. р53 может влиять на ангиогенез ГЦК, регулируя экспрессию VEGF. Saffroy и Guan Yongsong Song пришли к выводу, что у Р53-положительных пациентов в сыворотке крови опухоли чаще инвазируют кровеносные сосуды (P = 0,010). Не было значительной разницы в длине опухоли между Р53-положительными и отрицательными пациентами (P>0,05 по тесту ранговой суммы). 3.3 Связь между р53 и АФП Saffroy не обнаружил корреляции между антителами к р53 и АФП после анализа 130 европейских пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой. Дальнейшее исследование Guan Yongsong et al [11] показало, что среди 41 пациента с АФП меньше диагностического критерия 400 мкг/л, 10 были положительны на антитела к Р53. Молекулярно-биологические исследования также показали, что мутации в гене р53 могут появляться на ранних стадиях процесса гепатоцеллюлярного канцерогенеза и постепенно усиливаться по мере развития опухоли. Поэтому мы можем воспользоваться высокой специфичностью антитела Р53, которое может дополнить АФП в диагностике гепатоцеллюлярной карциномы и помочь диагностировать пациентов с АФП <400 мкг/л; в то же время для пациентов с АФП >400 мкг/л положительное антитело Р53 может повысить уверенность в диагнозе гепатоцеллюлярной карциномы. Кроме того, Shiota и др. проанализировали 86 случаев ГЦК и обнаружили, что позитивность антител Р53 была связана с билирубином крови и количеством опухолей, но не с размером опухоли. 4 р53 и генная терапия гепатоцеллюлярной карциномы Генная терапия открыла совершенно новый путь для лечения гепатоцеллюлярной карциномы, а ген р53 является наиболее значимым онкогеном для опухолей человека. В последние годы люди заменили нормальный ген p53 дикого типа на мутировавший ген p53 в опухолевых клетках, что показало лучший потенциал применения. Поиск эффективных и направленных векторных систем в настоящее время является ключом к клиническому применению генной терапии опухолей. 4.1 Вирусные векторы включают аденовирус и ретровирус. Райзер и др. продемонстрировали, что опосредованный аденовирусом перенос генов может эффективно вводить ген р53 в опухолевые клетки, а Теренс и др. использовали систему опосредованного рецепторами переноса генов для трансфекции клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы, содержащей р53 дикого типа, мутированным р53 и обнаружили, что это значительно подавляет ее рост. Guo Ying et al. ввели ген р53 в клеточную линию гепатоцеллюлярной карциномы -PLC/PRE/5 клеток путем экспрессии wtp53 рекомбинантным аденовирусным вектором, и подавили рост клеток путем индуцирования апоптоза и остановки клеточного цикла. В исследовании Shi Ming et al. наблюдалась высокая скорость трансфекции аденовируса в клетки гепатоцеллюлярной карциномы BEL402, HLE и HuH7, что указывает на то, что аденовирус может эффективно вводить целевой ген в клетки гепатоцеллюлярной карциномы и эффективно его экспрессировать. 4.2 Липосомный вектор Чжу Гуаньюй и др. показали, что использование липосом в качестве вектора имеет более высокую эффективность трансфекции, чем простое введение генов, и в то же время количество генов пропорционально эффективности трансфекции в определенном диапазоне. В то же время организм хозяина не проявляет специфического иммунного ответа из-за экзогенного вирусного гена, время экспрессии больше, чем у аденовирусного вектора, и трансфекции могут подвергаться как делящиеся, так и неделящиеся клетки. Исследование Лу Цинь и др. показало, что трансферрин может усилить трансфекцию липосомных генов. 4.3 Система слитых белков PTD Система слитых белков PTD считается перспективным средством доставки. Ding Zhongyang et al. успешно сконструировали прокариотический вектор экспрессии pTATHA/p53, содержащий ген p53, индуцировали экспрессию в E. coli BL21(DE3) LysS и очистили его. Очищенный белок р53 был иммунизирован внутрибрюшинно мышам BALB/c, и была получена высокоэффективная антисыворотка. Этот эксперимент заложил теоретическую основу для применения белка PTD-p53 в экспериментальном исследовании гепатоцеллюлярной карциномы. Кроме того, эукариотическая экспрессирующая плазмида p53-pcDNA3 Mu Hong et al. была трансфицирована на клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2, трансфекция и транскрипция экзогенной p53-cDNA в клетках HepG2-p53 были продемонстрированы с помощью гибридизации РНК in situ, а успешно введенная p53-cDNA могла индуцировать апоптоз в клетках HepG2, что имеет хорошие перспективы применения генной терапии опухолей. Важным механизмом опухолевого генеза является инактивация онкогенов и/или активация онкогенов. Введение нормального онкогена р53 в опухолевые клетки для замены и компенсации дефектного гена может кардинально подавить рост опухоли. Онкоген р53, безусловно, будет играть важную роль в диагностике и лечении рака печени.