Туберкулез (ТБ) — это хроническое истощающее инфекционное заболевание, вызываемое инфекцией Mycobacterium tuberculosis, представляющее серьезную угрозу для здоровья и жизни человека. По оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), если туберкулез не будет эффективно контролироваться, в период с 2000 по 2020 год 1 миллиард человек будет инфицирован Mycobacterium tuberculosis, у 200 миллионов человек разовьется туберкулезная болезнь, и 35 миллионов человек умрут от этого заболевания. Высокий уровень латентной инфекции Mycobacterium tuberculosis и коинфекция с ВИЧ делают профилактику, диагностику и лечение туберкулеза очень сложными.
БЦЖ — это живая аттенуированная вакцина, разработанная французскими учеными Камилем Гереном и Альбером Кальметтом путем длительного выращивания сильного штамма микобактерий туберкулеза in vitro. Она применяется для лечения людей с 1921 года, вакцинацией было охвачено более 3 миллиардов человек. В настоящее время БЦЖ все еще широко используется в развивающихся странах в качестве единственной противотуберкулезной вакцины. Хотя БЦЖ внесла важный вклад в профилактику туберкулеза, например, эффективно помогает предотвратить такие инфекционные заболевания, как туберкулез у детей, существует много проблем, например, большие разногласия по поводу иммунной защиты БЦЖ против туберкулеза у взрослых: уровень защиты составляет 0-80%, а обычно от 40% до 60%. Другие исследования показали, что БЦЖ блокируется уже существующим иммунным ответом организма в популяциях, ранее подвергавшихся воздействию микобактерий из окружающей среды или вакцинации БЦЖ, что приводит к иммунной недостаточности; поэтому БЦЖ эффективна только в популяциях, которые не были инфицированы микобактериями и не вакцинированы БЦЖ.
Таким образом, влияние микобактерий туберкулеза на здоровье человека и многочисленные проблемы вакцины БЦЖ делают разработку новой вакцины против туберкулеза очень актуальной.
I. Стратегии исследований и прогресс в разработке вакцин против туберкулеза
В настоящее время существуют два основных направления исследований вакцин против туберкулеза: одно из них — модификация существующей вакцины БЦЖ, например, разработка рекомбинантной вакцины БЦЖ; другое — разработка новых эффективных вакцин, например, создание субъединичных вакцин (включая белково-пептидные и ДНК-вакцины) и вакцин на основе вирусов.
Одной иммунизации только противотуберкулезной вакциной обычно недостаточно для создания хорошей иммунной защиты. Поэтому на основе первичной иммунизации для усиления иммунитета используется бустерная иммунизация той же или другой вакциной, т.е. стратегия первичной бустерной иммунизации. Эта стратегия важна для повышения иммунной эффективности противотуберкулезных вакцин, особенно для повышения иммунной защиты у взрослых больных туберкулезом. Эту стратегию можно разделить на стратегию гомологичной начальной бустерной иммунизации (начальная и бустерная иммунизация одной и той же вакциной) и стратегию гетерологичной начальной бустерной иммунизации (начальная и бустерная иммунизация разными вакцинами). Сообщалось, что стратегия гетерологичной начально-бустерной иммунизации вызывает более эффективный клеточный иммунный ответ, чем стратегия гомологичной начально-бустерной иммунизации, и, вероятно, является наиболее предпочтительным подходом для будущей иммунизации противотуберкулезными вакцинами. Существует два основных варианта противотуберкулезных вакцин, применяемых в стратегии гетерологичной первичной бустерной иммунизации: первичная иммунизация ДНК-вакциной и бустерная иммунизация вирусной векторной вакциной; и первичная иммунизация вакциной БЦЖ и бустерная иммунизация субъединичной вакциной. Основными противотуберкулезными вакцинами, изученными на сегодняшний день, являются рекомбинантная вакцина БЦЖ, белково-пептидная вакцина, ДНК-вакцина и живая векторная вакцина.
1. Рекомбинантная вакцина БЦЖ: Хотя БЦЖ безопасна и эффективна у детей, иммунная защита у взрослых является более спорной. С целью улучшения иммунной защиты БЦЖ у взрослых исследователи проделали большую работу, например, ввели гены, кодирующие иммунодоминантные антигены ТБ или иммуностимулирующие цитокины в БЦЖ для создания рекомбинантных вакцин БЦЖ, которые эффективно усиливают иммунную защиту БЦЖ. Кроме того, поскольку привитая вакцина БЦЖ легко сохраняется в фагосомах после фагоцитоза и является неактивной, это ослабляет ее стимулирующее действие на иммунные клетки, что влияет на интенсивность иммунного ответа. Поэтому создание рекомбинантной вакцины БЦЖ, которая индуцирует высвобождение БЦЖ из фагосом, также является мерой по повышению иммунитета. Была создана рекомбинантная вакцина БЦЖ, экспрессирующая PfoA, PfoA может индуцировать распад фагосом и высвобождать рекомбинантную БЦЖ в цитоплазму для усиления стимулирующего эффекта на CD8+ Т-лимфоциты, тем самым повышая уровень клеточного иммунного ответа.
Однако изучение рекомбинантной БЦЖ сталкивается с проблемой, что общая бактериальная система экспрессии не может хорошо функционировать для экспрессии генов БЦЖ, что создает большие трудности для конструирования экспрессионных векторов для БЦЖ. Для решения этой проблемы было проведено множество исследований транскрипционных сигнатур Mycobacterium tuberculosis, чтобы обеспечить хорошую основу для понимания транскрипции и экспрессии генов туберкулеза и различий между промоторами Mycobacterium tuberculosis и других бактерий, а также для решения проблемы экспрессии. Рекомбинантные вакцины БЦЖ, созданные с использованием экспрессионных векторов, содержащих промотор Mycobacterium tuberculosis, могут эффективно экспрессировать некоторые иммунодоминантные антигены, такие как Ag85A, Ag85B, Ag85C и 6×103 раннего секреторного целевого антигенного белка (ESAT6). Кроме того, рекомбинантная экспрессия цитокинов, таких как IFN и IL-12 в БЦЖ, может повысить уровень иммунного ответа, но есть также данные о том, что слишком высокий уровень местных цитокинов может вместо этого вызвать патологическое повреждение организма.
Рекомбинантные вакцины БЦЖ, которые в настоящее время проходят клинические испытания, — это рекомбинантная экспрессия вакцины Ag85A (r BCG 30) и рекомбинантная экспрессия лизата Listeria monocytogenes, BCG с дефицитом уреазы (VPM 1002)c9]. Хотя вакцина r BCG VPM 1002 завершила I фазу клинических испытаний в США, и разработчики указали, что вакцина обладает хорошей иммунной переносимостью и иммуногенностью, обнадеживающих результатов пока не получено.
2. Вакцина из белковых пептидов: Белковая пептидная вакцина не только обладает хорошей безопасностью, но и может специфически вызывать активацию CD4+ Th1 клеток и CD8+ цитотоксических Т лимфоцитов, что является одной из более идеальных форм вакцин. Выбор антигена и применение адъюванта могут сыграть решающую роль в ее разработке.
Белки или пептиды, используемые в качестве вакцинных кандидатов, выбираются из иммунодоминантных антигенов, содержащих распознающие эпитопы Т-лимфоцитов человека, в основном секретируемых белков и компонентов клеточной стенки Mycobacterium tuberculosis, таких как ESAT-6, Ag85, MTB39 и MTB32. Одиночных антигенов недостаточно для эффективной иммунной защиты из-за их узкого антигенного спектра; поэтому смешивание или слияние нескольких антигенов является мерой для улучшения иммунной защиты вакцины. Исследования показали, что слитые белки вызывают иммунную защиту более эффективно, чем смеси нескольких антигенов, но механизм неясен и может быть связан со стабильностью антигена, а также с эффективностью поглощения и доставки. Другие исследования показали, что между несколькими антигенами может существовать конкуренция, что снижает иммуногенность и иммунопротекцию вакцины. Поэтому при разработке многокомпонентных антигенных вакцин необходимо отдельно изучать иммунный эффект одного и смешанных антигенов.
Белковые пептидные вакцины требуют эффективного адъюванта, чтобы вызвать желаемый иммунный ответ, а различные адъюванты могут вызывать различные типы иммунных ответов, поэтому поиск подходящих адъювантов является важным вопросом, который необходимо решить при разработке белковых пептидных вакцин. Определенный прогресс был достигнут в соответствующих исследованиях, например, бактериальные токсины, цитокины, липосомы и CpG ДНК показали хороший иммуноукрепляющий эффект у экспериментальных животных.
В настоящее время в клинических испытаниях находятся следующие пептидные вакцины: Ag85B и ESAT-6 смешанный пептид (Hybrid 1-IC31) с IC31 в качестве адъюванта, Ag85B и ESAT-6 смешанный пептид (Hybrid1-CAF01) с CAF01 в качестве адъюванта, MTB39 и MTB32 слитый белок (M72) и Ag85B и TB10. 4 (Hybrid 4/AERAS 404-IC31), все из которых используются в качестве бустерных вакцин, а первые две — в качестве первых доз вакцины, причем сочетание адъювантов усиливает иммунный эффект этих вакцин. предварительные результаты клинических испытаний вакцины M72 свидетельствуют о ее безопасности и эффективности у взрослых, слабых побочных эффектах и иммунном ответе, который длится до 6 месяцев.
3. ДНК-вакцины: ДНК-вакцины представляют собой рекомбинантные плазмидные векторы, кодирующие антигенный белок, которые вводятся в организм хозяина для синтеза антигенного белка через систему экспрессии клеток хозяина, что позволяет хозяину приобрести иммунитет к данному антигену с целью профилактики и лечения заболевания. ДНК-вакцины могут вызывать иммунную защиту против различных вирусов, бактерий, паразитов и других патогенов, а также против туберкулеза в животных моделях. Иммунные ответы CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов.
Преимуществами этой вакцины являются.
(i) внутриклеточный антиген легко представляется основными молекулами комплекса гистосовместимости (MHC) класса I и II, которые активируют CTL и Th;
② Иммунный ответ является более продолжительным;
③ Стабильность, простота приготовления и хранения;
④Не вызывает иммунного ответа против вектора и может использоваться для повторной бустерной иммунизации;
⑤ Безопасна для использования у иммунодефицитных хозяев. Кроме того, ДНК-вакцина обеспечивает превосходную защиту у мышей с дефицитом CD4+ Т-лимфоцитов, что дает основание для разработки стратегий иммунизации в ВИЧ-положительных популяциях с высокой восприимчивостью к ТБ.
Хотя ДНК-вакцины могут вводиться без адъювантов, адъюванты могут значительно повысить иммунную эффективность ДНК-вакцин и уменьшить количество и частоту введения вакцины, и почти все адъюванты, используемые в белково-пептидных вакцинах, были опробованы для ДНК-вакцин с определенным успехом.
Несколько ДНК-вакцин против туберкулеза были использованы для вызывания эффективной иммунной защиты у мышей, например, ESAT-6, Ag85A/B, Mtb 8.4, Mtb 41, MPT 39, MPT 63, MPT 64, MPT 83 и hsp65. Однако защитный эффект ДНК-вакцины обычно составляет лишь от 50% до 80% от эффекта вакцины БЦЖ в тех же экспериментальных условиях, и ее защитные способности могут быть улучшены путем объединения нескольких ДНК-вакцин или создания экспрессионных векторов для нескольких антигенов. Кроме того, иммуногенность ДНК-вакцин против крупных млекопитающих обычно низкая, вероятно, из-за низкой эффективности трансфекции плазмид in vivo. Иммуногенность можно повысить, используя такие методы, как электрошок in vivo, нетоксичные бактерии или вирусы в качестве векторов.
4, живая векторная вакцина: живая векторная вакцина использует безопасные для организма микроорганизмы в качестве носителей и непрерывно экспрессирует специфические для ТБ антигены in vivo, что имеет преимущества экономичности и высокой эффективности, кроме того, живые векторы обладают определенными адъювантными эффектами. Обычно используются такие живые векторы, как поксвирусные векторы, аденовирусные векторы и др. Эти вакцины обычно используются при бустерной иммунизации для усиления иммунного ответа Т-лимфоцитов. Недостатком живых векторных вакцин является то, что уже существующий иммунный ответ организма может препятствовать иммунному антигенному ответу, тем самым ослабляя эффективность вакцины.
В настоящее время живые вирусные векторные вакцины, проходящие клинические испытания, включают рекомбинантно модифицированную вакцину Анкарского поксвирусного вектора А, экспрессирующую Ag85 (OxfordMVA85A/AERAS 485), репликационно-дефицитную аденовирусную векторную вакцину 35, экспрессирующую Ag85A, Ag85B и TBlO.4 (AERAS 402/CrucellAd35) и репликационно-дефицитный аденовирусный вектор 5, экспрессирующий Ag85A (AdAg85A), разработанные в качестве бустерных вакцин для БЦЖ и рекомбинантной БЦЖ.Oxford MVA85A/AERAS 485 показал хорошую безопасность и иммуногенность в различных популяциях.AERAS 402/Crucell Ad35 вызывает ответ CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов без серьезных побочных эффектов.
5. Другие вакцины против туберкулеза: термоинактивированная вакцина Mycobacterium mare (M-vaccae) — вакцина, полученная из микобактерий окружающей среды и содержащая многие антигены Mycobacterium tuberculosis. Завершена III фаза клинических испытаний на вакцинированных БЦЖ ВИЧ-инфицированных пациентах в Танзании. Вакцина M. smegmatis представляет собой цельноклеточный экстракт M. smegmatis, имеющий общие антигены с Mycobacterium tuberculosis, и была разработана Китайским институтом контроля фармацевтической и биологической продукции.
Кроме того, мутантный штамм БЦЖ оказывает определенное влияние на ингибирование созревания фагосом и может более эффективно осуществлять обработку и презентацию антигена для усиления иммунной защиты. Callewaert и др. сконструировали мутантный штамм БЦЖ, который обладает лучшей иммунной защитой, чем БЦЖ у мышей, и более высокой безопасностью.
II. Проблемы разработки противотуберкулезной вакцины
1. Отсутствие показателей, связанных с иммунной защитой: Клиническая защита большинства продаваемых вакцин может быть проверена с помощью альтернативных конечных точек, например, путем определения уровня антител, индуцированных вакциной, для определения иммунной защиты вакцины, но для иммунной защиты противотуберкулезных вакцин не было найдено соответствующих показателей. Хотя исследования подтвердили, что CD4+ и CD8+ и другие Т-лимфоциты могут вырабатывать различные типы цитокинов после заражения ТБ и иммунизации, и в последние годы использовались новые методы иммуноанализа для выявления и количественной оценки ответов Т-лимфоцитов, выделяющих специфические цитокины, эти исследования не выявили корреляции между специфическим клеточным или цитокиновым ответом и естественной инфекцией или иммунной защитой.
Отсутствие подходящих животных моделей: Оценка одного и того же кандидата в вакцины против ТБ варьируется в разных моделях животных, а Рид и др. обнаружили, что специфический для ТБ антиген обеспечил хороший иммунитет у мышей и морских свинок, но не сработал у нечеловекообразных приматов. Таким образом, существующие модели животных подтверждают, что иммунозащитная противотуберкулезная вакцина не гарантирует хорошей иммунозащиты у человека.
3. Отсутствие экономичных, чувствительных и специфических методов диагностики туберкулеза: Эффективность противотуберкулезных вакцин проверяется на основании клинических конечных точек. В настоящее время широко используемые клинические методы диагностики туберкулеза включают туберкулиновый кожный тест и бактериальную культуру, но эти методы имеют недостатки в виде низкой специфичности и неспособности выявить скрытую инфекцию; метод флуоресцентной количественной ПЦР чувствителен, но не может выявить скрытую инфекцию; тест высвобождения IFN-γ in vitro может эффективно решить эту проблему, но его продвижение ограничено высокой стоимостью туберкулеза, который в основном распространен в развивающихся странах. Поэтому создание экономичного, чувствительного и специфического метода диагностики ТБ необходимо для оценки клинической защиты вакцины.
4. ВИЧ-инфекция: Важным вопросом, стоящим перед разработкой всех вакцин, является безопасность и эффективность в ВИЧ-инфицированных группах населения, которые также подвержены высокому риску заболевания ТБ. По оценкам ВОЗ, по меньшей мере 6 миллионов человек в мире одновременно больны ТБ и СПИДом, а в некоторых африканских странах ТБ является основной причиной смерти больных СПИДом. Вакцинация их вакциной БЦЖ может привести к их заражению, а это очень небезопасно, поэтому это становится еще одной серьезной проблемой для разработки новых противотуберкулезных вакцин.
III. Перспективы
В последние годы уровень заболеваемости и смертности от туберкулеза резко возрос в связи с ВИЧ-инфекцией, широким применением иммуносупрессивных препаратов, распространением туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью и старением населения, что делает профилактику, диагностику и лечение туберкулеза очень трудным делом. Успешное искоренение оспы свидетельствует о том, что вакцина является эффективным способом полного искоренения инфекционного заболевания, и ВОЗ поставила цель полностью ликвидировать ТБ во всем мире (менее 1 случая на миллион человек) к 2050 году на основе прогресса в исследованиях новых вакцин против ТБ. В 2009 году по меньшей мере шесть кандидатов в вакцины против ТБ завершили фазу I клинических испытаний, а три вакцины в настоящее время проходят фазу II клинических испытаний, большинство из которых разрабатываются в качестве бустерных вакцин для БЦЖ. По оценкам ВОЗ, новая вакцина против ТБ будет утверждена для продажи в 2014-2015 годах, и она надеется иметь в резерве достаточные финансовые ресурсы и продукты для достижения цели быстрого достижения высокого охвата населения после появления вакцины. С развитием геномики, а также протеомики, понимание патогенеза Mycobacterium tuberculosis и иммунного ответа против инфекции также улучшается, что обеспечивает теоретическую основу для исследования более экономически эффективной вакцины против туберкулеза, которая представляет собой серьезную угрозу для здоровья человека.