Практическое применение генетического тестирования в клиническом лечении мезенхимальных опухолей желудочно-кишечного тракта было изучено путем проведения генетического тестирования у 13 пациентов с иммуногистохимически диагностированными мезенхимальными опухолями желудочно-кишечного тракта (GIST). Методы: 13 пациентам с GIST было проведено 15 генетических исследований методом ПЦР-амплификации генов, результаты которых и клинические данные были ретроспективно проанализированы. Результаты: в 15 генетических анализах было обнаружено десять мутаций в экзоне 11 гена C-kit, включая пять делеционных мутаций, две гетерозиготные делеции, две точечные мутации и одну инсерционную мутацию, а также одну дупликационную мутацию в экзоне 9 гена C-kit. Было получено 4 отрицательных результата генетического тестирования. Заключение: С развитием технологий генный анализ важен для диагностики мезенхимальных опухолей желудочно-кишечного тракта и выбора целевой терапии, и он должен стремиться стать рутинным тестом при мезенхимальных опухолях желудочно-кишечного тракта.
[Ключевые слова] генетическое тестирование; мезенхимальная опухоль желудочно-кишечного тракта
С установлением диагностических критериев GIST частота встречаемости мезенхимальной опухоли желудочно-кишечного тракта в клинической практике растет год от года, а с увеличением числа случаев постепенно увеличиваются и клинические проблемы. В 2007 году в Китае была введена целенаправленная терапия распространенных и рецидивирующих GIST, а послеоперационная целенаправленная адъювантная терапия GIST теперь широко доступна в крупных больницах. В связи с этим мы ретроспективно проанализировали 13 случаев мезенхимальных опухолей желудочно-кишечного тракта, находящихся под наблюдением нашего отделения, и обсудили их практическое применение в клинической практике в надежде, что они могут сыграть определенную роль в стандартизированном лечении мезенхимальных опухолей желудочно-кишечного тракта.
1. данные и методы
1.1 Общая информация
Все случаи в этой группе были пациентами с клинической иммуногистохимией, явно указывающей на мезенхимальную опухоль желудочно-кишечного тракта (GIST), которые подлежали лечению таргетными препаратами. Среди них было 7 мужчин и 6 женщин, в возрасте 36-86 лет, средний возраст 57,8 лет. Среди них было 8 случаев мезенхимальной опухоли желудка, 2 случая мезенхимальной опухоли тонкой кишки (включая один случай мезенхимальной опухоли двенадцатиперстной кишки), 1 случай мезенхимальной опухоли пищеводно-желудочного перехода, по 1 случаю мезенхимальной опухоли поперечной ободочной кишки и мезенхимальной опухоли прямой кишки. 6 из 13 пациентов с GIST получили послеоперационную адъювантную терапию иматинибом (Gleevec), и 6 выжили с опухолью. Среди них 4 получали таргетную терапию Gleevec и 2 — сунитиниб (Sotan). В одном случае от послеоперационной адъювантной терапии отказались по финансовым причинам.
1.2 Методы генетического тестирования
В этой группе случаев, в связи с клиническими ограничениями, образцы были отправлены на исследование с использованием парафинированных белых срезов, а методом обнаружения была ПЦР-амплификация генов. Период обнаружения составил с 2009 по 2012 год. Девять случаев были проверены в Медицинском лабораторном центре Гуанчжоу Цзиньвэй, два — в Аффилированной больнице Фуданьского университета, два — в Патологическом центре Второй больницы Чжэцзяна, один — в Первой больнице Чжэцзяна и один — в Патологическом центре Пекинского университета.
2. Результаты
В общей сложности было проведено 15 генетических исследований у 13 пациентов с мезенхимальными опухолями желудочно-кишечного тракта. В двух случаях было проведено два теста. В одном случае анализ генов первичной опухоли при мезенхимальной опухоли пищевода показал наличие делеционной мутации в экзоне 11 гена C-kit, а поскольку опухоль возникла еще в 2007 году, после операции адъювантная таргетная терапия не назначалась. В другом случае речь шла о мезенхимальной опухоли тонкого кишечника, при которой генетическое исследование в отделении патологии Второй больницы Чжэцзяна показало наличие изменений дикого типа, в то время как исследование в отделении патологии Пекинского университета показало наличие точечной мутации экзона 11 в гене C-kit. В целом, в 15 генетических анализах было выявлено 10 мутаций в экзоне 11 гена C-kit, из которых типы мутаций были следующие: делеционные мутации в 5 случаях, гетерозиготные делеции в 2 случаях, точечные мутации в 2 случаях и инсерционные мутации в 1 случае, а также дупликационные мутации в экзоне 9 гена C-kit в 1 случае.
Четыре генетических теста были отрицательными. Результаты генетических исследований, проведенных в этой группе, свидетельствуют о том, что мутации в гене C-kit часто встречаются у пациентов с GIST, и что преобладают мутации экзона 11, что согласуется с данными предыдущей литературы. Однако из-за небольшого количества случаев в этой группе не было обнаружено мутаций рецептора тромбоцитарного фактора роста (PDGFR-α). Это не соответствует литературным данным. Считается, что образцы в этой группе были отправлены в виде парафинированных белых срезов, что чревато ложноотрицательными результатами, и, если возможно, лучше создать банк образцов и отправлять на исследование свежие образцы тканей после своевременного замораживания в жидком азоте.
3. Обсуждение
3.1 Молекулярная биология и патогенез мезенхимальных опухолей желудочно-кишечного тракта
Для понимания клинического применения генетического тестирования при мезенхимальных опухолях желудочно-кишечного тракта важно понимать молекулярно-биологические особенности и механизмы их патогенеза. Патогенез мезенхимальных опухолей желудочно-кишечного тракта на генетическом уровне относительно хорошо изучен по сравнению с большинством мультигенно-мутированных опухолей. Мезенхимальные опухоли желудочно-кишечного тракта в основном характеризуются мутациями в генах C-kit и PDGFR-α. Оба гена кодируют белок C-kit и рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFR-α), которые относятся к семейству рецепторных тирозинкиназ III типа. Мутации в этих генах приводят к образованию аномальных белков, которые являются лиганд-независимыми и могут образовывать димеры, что приводит к автофосфорилированию тирозинкиназы, активации нижележащих сигнальных путей, таких как митоген-активируемая протеинкиназа и белки сигнальной трансдукции и активации, и устойчивой активации тирозинкиназ, что влияет на нормальный процесс пролиферации-апоптоза, приводя к неконтролируемой пролиферации клеток и образованию опухолей. Генетически мутации в гене kit присутствуют примерно в 80-85% мезенхимальных опухолей ЖКТ, а мутации в гене PDGFR-α — в 5-10%, причем мутации в обоих генах проявляют взаимоисключающий характер. Еще около 10% пациентов с GIST относятся к дикому типу, без выявляемых мутаций.
Наиболее распространенным типом мутации является делеция/делеция-инсерция, составляющая 66% случаев, приводящая к потере одной или нескольких аминокислот и иногда вставке одной или двух аминокислот, сконцентрированных в 5 конце экзона 11, вовлекая область кодона 1669-1704 (Lys550-Glu561). Удаление акцепторного сайта сдвига в экзоне 11 создает новый акцепторный сайт сдвига в экзоне 3 пре-мРНК, что приводит к внутрикаркасной делеции Lys550-Lys558 на уровне белка. Второй распространенный тип мутации — миссенс-мутация, которая также происходит в экзоне 11 на 5 конце, в основном затрагивая кодоны 557, 559 и 560.
Мутации C-kit составляют около 5-15% мутаций в экзоне 9 и в основном встречаются в мезенхимальных опухолях тонкого кишечника, которые обладают высокой биологической агрессивностью и являются одной из причин того, что мезенхимальные опухоли тонкого кишечника более злокачественны и имеют худший прогноз, чем мезенхимальные опухоли желудка. В основном все мутации в экзоне 9 представляют собой шесть нуклеотидных повторов, кодирующих Ala502-Tyr503dup (1525-1530dupGCCTAT). Существуют также частичные мутации C-kit, происходящие в экзоне 13, экзоне 14 и экзоне 17, последняя из которых, как считается, связана с устойчивостью к Gleevec. Частота первичных мутаций в этих трех последних экзонах низка — менее 2%.
У пациентов с GIST без мутаций в гене C-kit мутации PDGFR-α обнаруживаются примерно у трети пациентов, в основном в экзонах 12, 14 и 18. Мутации PDGFR-α происходят преимущественно в желудке, а микроскопическая морфология мезенхимальных опухолей часто носит эпителиальный характер, при этом типы мутаций включают точечные мутации, делеции, делеции-инсерции и инсерции, при этом наиболее распространенной является мутация 1821C>A. Кроме того, мутации генов C-kit и PDGFR-α не обнаруживаются примерно у 10% пациентов с GIST, которые называются GIST дикого типа. Патогенез пациентов дикого типа на генетическом уровне до конца не изучен.
3.2 Генетическое тестирование и целенаправленная терапия
Генетическое тестирование играет важную роль в целенаправленном лечении мезенхимальных опухолей желудочно-кишечного тракта. Во-первых, генетическое тестирование играет незаменимую роль в диагностике мезенхимальных опухолей. Некоторые клиницисты могут поставить это под сомнение, утверждая, что сочетание иммуногистохимии и микроскопической морфологии не оставляет сомнений в диагнозе GIST. Действительно, большинство GIST диагностируется при микроскопическом исследовании преимущественно веретенообразных клеток (50%-70%) или эпителиоидных клеток (20%-40%) и смешанных типов (10%), а иммуногистохимия положительна на CD117 и CD34. Однако пациенты с вышеупомянутой отрицательной экспрессией CD117 могут встречаться и в клинической практике, когда генетическое тестирование имеет незаменимое значение в диагностике.
В отделении автора был случай послеоперационного патологического диагноза мезенхимальной опухоли ЖКТ с тенденцией к гладкомышечной дифференцировке или гладкомышечной саркомы, но иммуногистохимия в двух больницах была отрицательной для CD117, и если диагноз мезенхимальной опухоли не мог быть четко установлен или окончательно исключен, было трудно принять решение о том, следует ли пациенту проводить послеоперационную адъювантную таргетную терапию. Генетическое исследование парафиновых срезов образца показало отсутствие мутаций в гене C-kit или гене PDGFR-α. Клиническое лечение заключалось в отказе от послеоперационной адъювантной терапии препаратом Gleevec, и пациентка наблюдалась более 1 года без рецидива метастазов.
В этой группе мы наблюдали случай мезенхимальной опухоли пищеводно-желудочного перехода. Через 2 года после резекции первичного поражения наблюдался местный рецидив, и морфология рецидивного поражения была расценена как послеоперационный рецидив мезенхимальной опухоли желудочно-кишечного тракта. Лечение было переведено на сотан, так как он не переносился, и рецидива метастазов не наблюдалось более 3 лет. В целом, генетическое исследование имеет диагностическое значение для пациентов с клинически подозреваемыми мезенхимальными опухолями, которые не могут быть диагностированы с помощью иммуногистохимии. Для этой группы пациентов клиническое рассмотрение целевой терапии должно опираться на генетическое тестирование для вынесения решения.
С широким распространением таргетной терапии мезенхимальных опухолей ЖКТ в настоящее время существует общий консенсус относительно взаимосвязи между генетическими мутациями и таргетной терапией у пациентов с GIST, а взаимосвязь между типом мутации у пациентов с GIST и наиболее часто используемой таргетной терапией первой линии, Гливеком, является областью наибольшего внимания исследователей. В настоящее время общепризнано, что при распространенной мутации экзона 11 гена C-kit целевая терапия препаратом Gleevec обладает наибольшей чувствительностью у пациентов с такими мутациями. Сообщалось, что можно достичь до 6% CR, 61% PR, 25% SD и 3% PD [1]. У пациентов с мутациями экзона 9 в гене C-kit была получена хорошая чувствительность благодаря тому, что лечение препаратом второй линии сунитинибом было назначено после возникновения резистентности к гливеку, и были достигнуты значительно большие результаты при лечении сунитинибом по сравнению с группой с увеличенной дозой гливека [2].
Некоторые эксперты теперь считают, что ранний переход на лечение сунитинибом может быть рассмотрен для пациентов с результатами генетического тестирования на мутации экзона 9 в гене C-kit, у которых развивается резистентность к препарату. Еще более радикальные взгляды предполагают, что после обнаружения мутации экзона 9 C-kit можно рассматривать возможность проведения таргетной терапии первой линии с использованием сунитиниба. В нашей группе есть пациент с мутацией экзона 9, 8 лет после мезенхимальной опухоли желудка с местным рецидивом и метастазами в печень, в настоящее время принимает таргетную терапию Gleevec, тщательно наблюдался более 9 месяцев, поражение находится в состоянии SD, в настоящее время по-прежнему каждые 3 месяца проводится компьютерная томография, как только наблюдается прогрессирование поражения, мы намерены оперативно перейти на лечение Sotan. У пациентов с GIST дикого типа таргетная терапия относительно менее эффективна, чем у пациентов с явными генетическими мутациями.
В этой группе был случай поперечной мезентериальной мезенхимальной опухоли, которая клинически оценивалась как среднего и высокого риска и требовала послеоперационной адъювантной таргетной терапии, но ее генетический тест был дикого типа, хотя 23% PR и 50% SD были достигнуты у пациентов дикого типа при таргетной терапии, если они выживали с опухолью, но также было достигнуто 19% PD. Мы решили воздержаться от послеоперационной адъювантной таргетной терапии и внимательно наблюдали за пациенткой в течение 9 месяцев. У пациентов с мутациями PDGFR-α связь с таргетной терапией Гливеком не совсем ясна из-за их низкой распространенности, но ясно то, что мутации экзонов 12 и 14 в гене PDGFR-α чувствительны к терапии Гливеком в тестах in vitro, но мутации экзона 18, особенно форма мутации D842V, устойчивы к терапии Гливеком [3].
3.3 Генетическое тестирование и прогноз пациентов с мезенхимальными опухолями желудочно-кишечного тракта
Генетическое исследование тесно связано с прогнозом мезенхимальных опухолей желудочно-кишечного тракта. Во-первых, как уже упоминалось ранее, пациенты с различными типами мутаций мезенхимальных стромальных опухолей имеют разную чувствительность к таргетной терапии Gleevec. В настоящее время единственным препаратом первой линии для стандартизированного лечения мезенхимальных опухолей ЖКТ является Gleevec, поэтому чувствительность к таргетной терапии Gleevec напрямую зависит от прогноза пациента, особенно для пациентов с местным рецидивом, нерадикализованными опухолями или метастазами в печень. В настоящее время считается, что прогноз пациентов с мезенхимальными опухолями ЖКТ коррелирует с местом возникновения опухоли, или что злокачественность мезенхимальных опухолей ЖКТ связана не только с размером опухоли и количеством ядерных делений при большом увеличении, но и тесно связана с местом возникновения опухоли. В целом, прогноз мезенхимальных опухолей, возникающих в желудке, лучше, чем в тонкой кишке.
На генетическом уровне мезенхимальные опухоли желудка чаще имеют мутации экзона 11 в гене C-kit, а мезенхимальные опухоли тонкого кишечника имеют относительно высокое количество мутаций экзона 9 в гене C-kit. Как уже упоминалось ранее, первые более чувствительны к таргетной терапии препаратом Gleevec. Кроме того, тип мутации связан с прогнозом пациента. Было показано, что мутации в гене C-kit являются независимым прогностическим показателем, причем у больных с мутациями выше частота послеоперационных рецидивов и ниже 5-летняя выживаемость, чем у больных без мутаций [4]. В целом, прогноз хуже для тех, кто имеет делеционные мутации в гене C-kit. Было высказано предположение, что мезенхимальные опухоли желудка с делеционными мутациями в экзоне 11 гена C-kit более агрессивны, чем те, которые имеют мутации замены, но в мезенхимальных опухолях тонкого кишечника нет существенной разницы между опухолями с делеционными мутациями в экзоне 11 гена C-kit и опухолями с точечными мутациями. В связи с небольшим количеством случаев в этой группе, сравнение подгрупп по взаимосвязи между типом мутации и прогнозом не проводилось. Прямая корреляция между мутациями в экзоне 9 гена C-kit и клиническим прогнозом на данный момент не ясна. Мутации в гене PDGFR-α чаще встречаются в мезенхимальных опухолях желудка и предполагают лучший прогноз в целом.
В целом, генетическое исследование пациентов с мезенхимальными опухолями ЖКТ важно для дальнейшего уточнения диагноза, прогноза, чувствительности к таргетной терапии и сроков перехода на лечение сотаном в случае резистентности к Гливеку. Цена генетического тестирования для пациентов с мезенхимальными опухолями желудочно-кишечного тракта значительно снизилась с развитием технологии клинического тестирования, и в настоящее время цена тестирования на один локус составляет около 400-500 юаней. Поскольку целевые методы лечения все еще очень дороги, генетическое тестирование является важным руководством к действию. Рекомендуется регулярно проводить генетическое тестирование, если пациент имеет для этого финансовые возможности. Генетическое тестирование особенно рекомендуется для пациентов, которым предстоит целевая терапия, или для пациентов с мезенхимальными опухолями, которые клинически рецидивируют или выживают, и имеет особое значение для нашего клинического ведения и лечения. Однако в генетическом тестировании все еще существуют проблемы, такие как непоследовательные стандарты, противоречивые результаты при тестировании в нескольких подразделениях, образцы все еще в основном отправляются в парафиновых срезах, которые склонны к ложноотрицательным результатам, и т.д. Ожидается, что с дальнейшим развитием технологии генетического тестирования будут достигнуты улучшения.