Биологическое лечение дегенерации диска включает в себя множество различных терапевтических подходов. В широком смысле терапевтические подходы включают клеточное, матричное и молекулярное применение, и данная глава посвящена молекулярной терапии. Терапевтические молекулы включают полный спектр терапевтических молекул, а не только классические «факторы роста». Эта номенклатура важна, поскольку факторы роста названы так за их влияние на клеточный митоз, но терапевтический эффект эффективных терапевтических молекул не всегда достигается за счет влияния на репликацию клеток. Терапевтические молекулы можно классифицировать как антиметаболиты, проапоптотические факторы, хондрообразователи и внутриклеточные регуляторные молекулы. В этой главе рассматривается основная литература и дается определение каждой из этих классификаций. Понимание процесса дегенерации диска помогает в понимании молекулярной терапии. Процесс дегенерации диска включает потерю протеогликанов, воды и коллагена II типа из матрикса пульпозного ядра. Некоторые неопределенные изменения в матриксе, такие как полимерные протеогликаны и другие, трудно оценить количественно. Изменения в фиброзных кольцах включают нарушение кольцевых пластинок и дефекты в коллагеновом матриксе. Как правило, эти изменения матрицы занимают многие годы и в основном вызваны дисбалансом между синтезом и катаболизмом. Цель молекулярной терапии — остановить изменения во внеклеточном матриксе диска, сбалансировав синтез и катаболизм. Ниже приведены конкретные классификации. I. Антиметаболические эффекты Потеря матрикса — это баланс между синтезом и катаболизмом, поэтому внеклеточный матрикс диска может быть увеличен путем увеличения синтеза или уменьшения катаболизма. Один из подходов заключается в том, чтобы остановить потерю матрикса путем ингибирования активности катаболических ферментов. Во внеклеточном матриксе существует множество катаболических ферментов, среди которых матриксные металлопротеиназы (ММП) являются наиболее важной группой, играющей важную роль в утилизации молекул внеклеточного матрикса и в дегенерации диска. Эта гипотеза подтверждается значительно более высокими уровнями ММП в дегенерированных дисках. Во внеклеточном матриксе ингибиторами ММП в основном являются тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ (ТИМП), и Уоллах проверил, могут ли эти антикатаболические молекулы (ТИМП-1) увеличить количество протеогликанов в матриксе с помощью аденовирусного пути трансдукции генов in vitro. Он обнаружил, что экспрессия TIMP-1 в клетках межпозвоночных дисков действительно увеличивала количество протеогликанов, а также скорость синтеза протеогликанов. Другой мощной молекулой является CPA-926, предшественник гесперидина, но с лучшими фармакокинетическими свойствами. CPA-926 обладает противовоспалительными и противоопухолевыми свойствами и предотвращает дегенерацию хряща при остеоартрите. okuma показала, что CPA-926 может предотвратить или отсрочить начало высокой дегенерации диска, давая его перорально кроликам с дегенерацией диска, и обнаружила, что CPA-926 может предотвратить или отсрочить начало высокой дегенерации диска. гистологическое подтверждение дегенерации диска. Скорость метаболизма матрицы также важна в контексте баланса между синтезом и катаболизмом. Например, скорость метаболизма диска значительно выше у молодых людей, чем у пожилых, что также может вызвать изменения в составе матрикса, например, дегенерированные агрегированные протеогликаны и вновь синтезированные агрегированные протеогликаны (из хряща). Общая скорость метаболизма также может влиять на потребности клеток диска в питательных веществах. Цитокины, такие как IL-1 и TNF-a, играют важную роль в метаболизме дисков. Однако некоторые молекулы, такие как IL-1Ra и инфликсимаб, могут блокировать эффекты IL-1 и TNF-a соответственно и также полезны в терапевтическом плане. Дальнейшие исследования антиметаболических молекул могут привести к новым открытиям. II. Про-апоптотические факторы Про-апоптотические факторы — это класс молекул, которые увеличивают скорость митоза клеток, они составляют истинные факторы роста, и поэтому мы можем отличить про-апоптотические факторы роста от хондрогенных молекул, к которым относятся инсулиноподобный фактор роста (IGF-1), эпидермальный фактор роста (EGF) и фактор роста фибробластов (FGF). Томпсон продемонстрировал in vitro на клетках межпозвоночного диска взрослой собаки, что IGF увеличивает скорость митозов и скорость синтеза протеогликанов в клетках, при этом EGF в целом был более мощным. Уровень IGF-1 в межпозвоночных дисках крыс снижался с возрастом, поэтому исследователи пришли к выводу, что синтез матрикса может быть увеличен путем увеличения IGF-1 в старых дисках. Результаты исследований Уолша in vivo с факторами роста в дегенеративной модели компрессии каудального диска у крыс соответствовали результатам Томпсона in vitro, оба показали незначительный эффект IGF-1, в то время как FGF не оказали практически никакого влияния. Другие факторы роста также могут предотвращать апоптоз клеток диска с помощью тех же или иных механизмов. Грубер продемонстрировал, что клетки диска апоптотичны в среде с низким содержанием сыворотки in vitro, но добавление IGF-1 или PDGF снижает скорость апоптоза. igf-1 обладает просинтетическим, но также и прокатаболическим эффектом. В анализах культуры ткани IGF-1 снижал уровень TIMP-2, поэтому считается, что он оказывает двойное влияние на метаболизм матрикса межпозвоночного диска III. Хондроцитообразующий гормон Хондроцитообразующий гормон — это класс цитокинов с про-апоптотической способностью, но с основной характеристикой повышения специфических фенотипов хондроцитов. Эти специфические свойства хондроцитов определяются коллагеном II типа, геном Sox9, агрегированными протеогликанами и Сульфатированный аминоглюкан. Большая часть исследований хондроцитообразующих элементов была посвящена трансформирующим факторам роста (TGF-b), остеогенным белкам (BMPs) и факторам дифференциации роста (GDFs). Хондроцитообразующие гормоны привлекли внимание благодаря своей способности изменять фиброзный фенотип нормальных клеток межпозвоночного диска на фенотип хондроцитов. Эти молекулы действуют аутокринным, паракринным и эндокринным образом, и они способны оказывать большое влияние, распространяясь и воздействуя на различные клетки. Активность прототипичных хондроцитообразователей определяется рецепторами внеклеточной поверхности и активными внутриклеточными системами обмена сообщениями соответствующих клеток, тогда как клетки межпозвонкового диска способны экспрессировать молекулы и рецепторы TGF, BMP, причем уровень экспрессии меняется по мере старения диска. TGF-b1 был первой идентифицированной дискогенной молекулой, и Томпсон сообщил, что TGF-b1 является не только митогеном, но и проанаболической молекулой, способной увеличивать синтез клеточного протеогликана, и что его способность увеличивать синтез протеогликана превосходит способность таких факторов роста, как EGF, IGF-1, PDGF и FGF. Позже Нишида продемонстрировал, что аденовирусный вектор, несущий ген TGF-b1, может быть введен непосредственно в межпозвоночные диски иммунных кроликов и может увеличить синтез протеогликана за счет экспрессии TGF-b1. Анализы in vitro с клетками дегенерированного диска человека также показали, что TGF-b1 увеличивает скорость синтеза протеогликанов и коллагена, что говорит о том, что клетки дегенерированного диска все еще чувствительны к TGF-b1. Анализы in vitro на клетках хвостового диска крысы продемонстрировали пролиферативный эффект TGF-b1 на клетки внутреннего фиброзного кольца, но он не привел к значительному изменению высоты диска. Хотя TGF-b1 обладает таким эффектом, его роль в живых межпозвоночных дисках человека остается недоказанной. BMP-2 является еще одним прототипическим хондроцитообразующим элементом, и Хаттон сообщил, что рекомбинантный человеческий BMP-2 увеличивал синтез протеогликанов в клетках диска крысы и значительно повышал фенотип хондроцитов в клетках диска, а также увеличивал экспрессию генов агрегированных протеогликанов и коллагена II типа, но не было значительных изменений в коллагене I типа. Ким сообщил, что BMP-2 частично отменяет ингибирующий эффект никотина на синтез протеогликанов клетками межпозвоночного диска. Известно, что BMP-2 способствует терминальной дифференцировке остеобластов во время формирования кости, но еще предстоит выяснить, способствует ли BMP-2 также дифференцировке клеток межпозвоночного диска, как показали тесты in vitro на клетках межпозвоночного диска человека, где BMP-2 увеличивал экспрессию генов хондроцитов, но не влиял на гены остеобластов. Проанаболический эффект BMP-2 был дополнительно продемонстрирован селективным применением генной терапии к клеткам межпозвоночного диска in vitro во время операции на позвоночнике. На сегодняшний день все еще нет исследований о воздействии BMP-2 на живые дегенерированные диски человека, что является актуальной темой исследований. BMP-7 (также известный как остеогенный белок OP-1) также является цитоформером межпозвоночного диска, и Масуда сообщил о дозозависимой зависимости между ростом клеток межпозвоночного диска кролика фиброзного кольца и ядра пульпозного происхождения и BMP-7 in vitro. Такегами продемонстрировал, что рост клеток диска крысы в альгинатной среде с добавлением воспалительного фактора IL-1 привел к потере протеогликанов и коллагена в альгинате, тогда как протеогликанов и коллагена в среде после добавления 200 мг/мл BMP-7 было даже больше, чем в отсутствие IL-1. Чжан сообщил о повышенной пролиферации всех трех фракций клеток межпозвоночного диска крупного рогатого скота (из внешней зоны фиброзного кольца, внутренней зоны и пульпозного ядра, соответственно), культивируемых in vitro в ответ на BMP-7. Однако только клетки из внешней зоны фиброзного кольца и пульпозного ядра показали повышенную скорость синтеза протеогликанов. Были начаты испытания с использованием BMP-7 в модели дегенерации диска у кроликов, которые показали, что прямое интрадискальное введение BMP-7 увеличивает высоту диска и уровень протеогликанов у кроликов. Данные этих испытаний также свидетельствуют о том, что интрадискальное введение BMP-7 также эффективно при дегенерации дисков у крыс. BMP-13 также известен как фактор дифференциации роста (GDF-6) или хрящевой морфогенетический белок-2 (CDMP-2). Хотя BMP-13 принадлежит к семейству BMP, его аминокислотная последовательность лишь на 50% гомологична BMP-2. Хотя BMP-13 не синергирует с BMP-2 в синтезе протеогликанов и экспрессии генов хондроцитов, их совместный эффект является кумулятивным. BMP-13 не является рекомбинантным белком, который можно производить в больших количествах, что затрудняет проведение исследований, требующих большого количества BMP-13. Уолш сравнил действие GDF-5, TGF-b1, IGF-1 и FGF на крысиной модели дегенерации каудального диска и обнаружил, что GDF-5 была единственной молекулой, которая увеличивала высоту диска по сравнению с солевым контролем. Кроме того, на срезах тканей наблюдалась пролиферация клеток в медиальной полосе и миграционной зоне фиброзного кольца. Однако при повторных инъекциях возникала воспалительная реакция, которую авторы связывают с травмой при инъекции, а не с GDF-5, поскольку такая же воспалительная реакция наблюдалась даже в контрольной группе физраствора.Ванг использовал генную терапию, чтобы продемонстрировать, что аденовирусная трансдукция GDF-5 способствует росту культивируемых клеток диска in vitro.GDF-5 разрабатывается на коммерческой основе для скрепления позвоночника, однако все еще требуется большое количество рекомбинантных белков. для проведения клинических исследований. Link N — это аминоконцевой фрагмент линкерного белка, который, как показал Mwale, обладает стимулирующей активностью в отношении клеток межпозвоночного диска. Анализ культуры гранул показал, что Link N увеличивает синтез протеогликанов, но не количество клеток, при этом коллаген II типа увеличился на 113% в клетках, полученных из пульпозного ядра, и на 25% в клетках, полученных из фибриллярного кольца. Механизм, с помощью которого Link N вызывает специфическое повышение уровня важного маркера хондроцитов (коллагена II типа), но не увеличивает количество клеток, остается неясным. Однако эти результаты уже позволяют предположить, что Link N также является прохондрогенным формирователем. Внутриклеточные регуляторные молекулы — это особый класс молекул, которые не действуют через трансмембранные рецепторы. Они не являются ни цитокинами, ни факторами роста, но выполняют ту же роль, что и секретируемые молекулы, о которых говорилось ранее. Эти молекулы обычно контролируют одно или несколько направлений клеточной дифференциации. SMADs, например, представляют собой класс внутриклеточных молекул, которые регулируют BMP-R. Хотя о роли SMADs на клетки межпозвоночного диска до сих пор ничего не написано, была выдвинута гипотеза, что он может оказывать на клетки диска такое же действие, как и BMP-2, увеличивая синтез протеогликанов и коллагена II типа. Пол продемонстрировал, что аденовирусная трансдукция гена Sox9 увеличила экспрессию Sox9 и синтез коллагена II типа в клетках межпозвоночного диска in vitro. При введении в организм аденовирус, несущий Sox9, предотвращал дегенеративные изменения в модели межпозвоночного диска annulus fibrosus у кроликов. В модели дегенеративного диска использовалась пункционная игла 27 калибра, которая вызывала минимальное повреждение диска и, следовательно, минимальную дегенерацию. Основным результатом этого исследования in vivo было то, что диски, обработанные Sox-9, имели более хондроцитоподобный фенотип по сравнению с контрольной группой, однако в данном отчете не представлены количественные данные о его влиянии на матрикс диска или его состав. Минерализующий белок (LMP-1) — это класс внутриклеточных молекул, идентифицированных по их роли в стимулировании формирования костной ткани и дифференциации остеобластов. Юн обнаружил, что в клетках межпозвоночных дисков LMP-1 стимулирует выработку BMP-2, BMP-7 и протеогликанов не только в монослойных культурах, но и в пролонгированных (3-недельных) альгинатных культурах. Юн продемонстрировал, что механизм действия LMP-1 является BMP-зависимым. Последующие эксперименты in vivo в межпозвоночных дисках кроликов показали, что небольшие дозы аденовируса, трансдуцирующего LMP-1, увеличивали уровни мРНК BMP-2, BMP-7 и протеогликанов в ткани межпозвоночного диска. Поскольку LMP-1 стимулирует образование гетеродимеров BMP-2 и BMP-7, его эффект в 20 раз превышает эффект гомодимеров. Предполагается, что снижение риска аденовирусной генной терапии может быть достигнуто путем уменьшения дозы аденовируса под действием индуцированного супер BMP. V. Резюме Молекулы, используемые при дегенерации диска, — это уже не просто классические факторы роста, существует по крайней мере четыре класса молекул, оказывающих восстанавливающее действие на диск. Существуют антиметаболиты, про-апоптотические факторы, формагены, производимые хондроцитами, и внутриклеточные регуляторные молекулы. Хотя существует лишь несколько данных испытаний in vitro и очень мало результатов in vivo, полученных на животных моделях дегенерации диска, нынешние скрининговые испытания подходят к концу, и в ближайшем будущем исследования на животных моделях дегенерации диска начнутся раньше, чем на людях.