Материалы и методы:
Материалы: Эксперименты проводились в Пекинском институте сердечно-легочных и сосудистых заболеваний — ключевой лаборатории сердечно-сосудистого ремоделирования, Пекин, Китай, с июля 2011 по апрель 2012 г. Мыши чистого класса BSL-C57 были приобретены у Beijing Viton Lever Laboratory Animal Company, фетальная бычья сыворотка и среда LG-DMEM были приобретены у GIBICO.
Методы:
1. Выделение и культура клеток:
У 4-недельных мышей C57 снимали шейные позвонки и казнили, удаляли бедренную и большеберцовую кости, отделяли и удаляли мышечную ткань, обнажали полость костного мозга в асептических условиях, клетки в полости костного мозга многократно промывали стерильной культуральной средой DMEM, крупные тканевые массы удаляли фильтрацией через нейлоновую сетку 200 меш. Собранную клеточную суспензию центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин, клетки ресуспендировали и инокулировали в среду LG-DMEM, содержащую 10% FBS, среду меняли в течение 24 ч и затем каждые два дня, и первичную культуру клеток (P0) проводили в CO2-инкубаторе при 37°C с объемной долей 0,05. Когда клетки на 90% распределились по дну флакона, клетки переваривали с помощью 0,25% ЭДТА-трипсина. Клетки переваривали и культивировали в пассажах 1:2 (P1, P2, P3, …). Среду меняли каждые два дня, а морфологические изменения клеток регистрировали под инвертированным микроскопом.
2. Проточно-цитометрическая идентификация:
Клетки культивировали до 5-го поколения, переваривали с 0,25% ЭДТА-трипсином и концентрацию клеток доводили до 1×107/мл раствором PBS. Брали 5 проточных пробирок и добавляли 100 мкл суспензии клеток, затем PE-anti-CD90, PE-anti-CD34, FITC-anti- CD45, FITC-анти-CD73 флуоресцентно меченых антител и пустых клеток в качестве контроля, после встряхивания инкубировали в течение 30 мин при 4℃, дважды промывали PBS, фильтровали для удаления клеточных комков и подвергали проточной цитометрии.
3. Производство и идентификация клеточных пластырей миокарда:
Вырезать материал пластыря на круглые пластыри диаметром 0,5 см с помощью дырокола после дезинфекции этиленоксидом, инфильтрировать пластыри культуральной средой, подождать, пока пластыри полностью не будут инфильтрированы культуральной средой, промыть 3 раза буфером PBS, поместить в 96-луночные планшеты и отложить в сторону, держать клеточные пластыри плоскими, использовать культуральную среду до выращивания клеток. После 24 ч инфильтрации удалите среду и подсчитайте 1×105 клеток на лунку к патчу после переваривания 0,25% трипсином.
A. Подготовка образцов для электронной микроскопии:
Образцы совместного культивирования промывали 3 раза деионизированной водой, фиксировали 0,25% глутаральдегидом 500 мкл, погруженные клеточные пластыри хранили при 4℃ и превращали в образцы для сканирующей электронной микроскопии, а затем определяли на установке.
B. Метод флуоресцентного мечения для наблюдения за ростом и пролиферацией клеток:
Мышиные БМСК превращали в суспензию клеток в концентрации 1×107 л-1 и инокулировали в 24-луночный планшет (каждая лунка содержала 500 мкл культурального раствора DMEM с 10% FBS по объему), по три лунки на каждый образец материала. Клетки инкубировали в инкубаторе при 5% v/v CO2, 37°C, насыщенной влажности в течение 24 ч. После прикрепления клеток к стенке культуральную среду отбрасывали и фиксировали в параформальдегиде в течение 10 мин. Данные подсчитывали.
Обработка данных:
Подсчет клеток анализировали с помощью статистического программного обеспечения SPSS 12.0, сравнение между группами проводили с помощью ANOVA, при этом различия считали статистически значимыми при P<0,05. Результаты идентификации методом проточной цитометрии анализировались с помощью программного обеспечения EXPOTM32ADC.
Результаты:
1. БМСК под световой микроскопией:
БМСК имели разнообразную морфологию клеток на ранней стадии световой микроскопии, в основном круглые, овальные, палочковидные или веретенообразные с ростом «колонии» около 4-6 дней, клетки быстро расширялись, излучая и спиралируя наружу, достигая 80%-90% через две-три недели. Клетки имеют веретенообразную форму и энергично размножаются, сохраняя вихревой характер роста.
2. Проточная идентификация клеток:
БМСК 3-го поколения были идентифицированы с помощью проточной цитометрии, результаты были отрицательными для CD34 и CD45, слабо положительными для CD90 и положительными для CD73.
3. Результаты электронной микроскопии:
Поверхность пластыря из материала PU напоминала нерегулярную поверхность, образованную гранулоподобной агрегацией при сканирующей электронной микроскопии, поверхностные клетки были нормальными по морфологии, больше по количеству и неравномерно распределены, можно было увидеть несколько фрагментов клеток и лизис других клеток) Материал представлял собой волокнистую переплетенную сетчатую структуру с трехмерной структурой, равномерными порами, хорошим ростом клеток, нерегулярной морфологией, без очевидных фрагментов клеток и лизиса других клеток. Поверхность материала из PPC материала гладкая с периодическими углублениями, количество клеток на поверхности очень мало, с некоторыми фрагментами клеток и лизатами других клеток.
4. Подсчет под инвертированным микроскопом после флуоресцентного мечения ядер клеток:
Среднее количество клеток под флуоресцентным микроскопом в 400 раз составило 143,78±38,38 для группы материала PU, 159,50±33,07 для группы материала P(3HB-co-4HB) и 1,40±0,70 для группы материала PPC.SPSS12.0 программное обеспечение ANOVA. Средние значения количества клеток статистически не отличались между группами PU и P(3HB-co-4HB) (P=0.942) и статистически отличались между группами PPC и PU (P1) и P(3HB-co-4HB) (P2) (P1=0.000, P2=0.000).
Обсуждение:
BMSC — относительно примитивные стромальные клетки костного мозга, полученные из костного мозга мезенхимальные стволовые клетки обладают сильным потенциалом дифференцировки и могут быть вовлечены в ангиогенез через латеральную дифференцировку в кардиомиоциты, слияние клеток, прямую дифференцировку в эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки [13, 14], и паракринное действие для активации эндогенных механизмов восстановления, чтобы играть роль в восстановлении поврежденных сердец [15]. ], что заставило ученых уделить большое внимание клиническому применению МСК в восстановлении тканей и генной терапии. Благодаря своему потенциалу восстановления миокарда и сосудов, они стали одним из самых популярных источников клеток в исследованиях по тканевой инженерии миокарда. Клеточная миокардиопластика в основном проводится путем пересадки клеток для лечения инфаркта миокарда, но после пересадки клеток происходит потеря пересаженных клеток, так как кровоток омывает клетки и механическая активность сердца [16]. Поэтому для улучшения выживаемости и пролиферации пересаженных клеток в области инфаркта миокарда и, таким образом, для улучшения прогноза необходим материал, обеспечивающий хорошую среду обитания для клеток, обладающий определенными физическими свойствами и хорошей биогистосовместимостью, а также деградацией и поглощением in vivo.
Полиуретан (ПУ) был впервые изобретен немецкими химиками, а в нашей стране появился в 1950-х годах и быстро развивался. ПУ-эластомеры могут использоваться в широком диапазоне твердости с высокой эластичностью и прочностью, отличной износостойкостью, маслостойкостью, усталостной прочностью и антивибрационными свойствами. Благодаря своим отличным общим характеристикам полиуретан широко используется в текстильной, полиграфической, медицинской, спортивной, пищевой промышленности, строительстве и других отраслях.
Сополиэфир 3-гидроксимасляной кислоты и 3-гидроксигексановой кислоты (P(3HB-co-4HB)) — это новый материал третьего поколения PHA, который привлек широкое внимание благодаря своим хорошим физическим свойствам. P(3HB-co-4HB) был обнаружен и синтезирован в качестве нового тканеинженерного материала в лаборатории Института исследований полимеров, факультет химического машиностроения, Университет Цинхуа. Было показано, что P(3HB-co-4HB) обладает лучшими свойствами биосовместимости и поглощения деградации, чем PHB. <Хотя клетки могут выживать на миокардиальном пластыре из материала P(3HB-co-4HB), а материал P(3HB-co-4HB) обладает хорошей биосовместимостью, свойствами деградации и поглощения, влияние деградации и поглощения материала пластыря на организм еще предстоит изучить, а влияние имплантации материала пластыря на иммунную систему организма не ясно. Возможность использования материала P(3HB-co-4HB) в качестве пластыря для миокарда и его дальнейшая биологическая токсичность и функция нуждаются в дальнейшем изучении.
В целом, существуют различные исследования в выборе клеточных миокардиальных пластырей. Экспериментально, стволовые клетки были успешно выращены на пластырях из материала PU и материала P(3HB-co-4HB), но нерассасывающиеся свойства материала PU ограничивают его использование в области медицинских биоматериалов, в то время как материал P(3HB-co-4HB) является новым биоматериалом. , который обладает хорошей биогистосовместимостью и физическими свойствами и всасывается в живых организмах, может быть хорошим выбором в качестве материала для клеточных миокардиальных пластырей, но целесообразность и дальнейшая биологическая токсичность и функция материала P(3HB-co-4HB) в качестве миокардиального пластыря требует дальнейшего изучения.