Цель: Изучить влияние основного фактора роста фибробластов (bFGF) и антитела к его рецептору на ультраструктуру эпителиальных клеток хрусталика человека (HLECs). Методы: Трансмиссионная электронная микроскопия использовалась для наблюдения ультраструктурных изменений нормальных HLECs и bFGF после действия bFGF и антитела рецептора, блокирующего действие bFGF в HLECs. Результаты: нормальные HLEC имели больше митохондрий, шероховатый эндоплазматический ретикулум, свободные рибосомы и несколько микрофиламентов, неповрежденную ядерную мембрану и гомогенный хроматин. При действии bFGF наблюдалась неповрежденная клеточная мембрана с большим количеством локальных выступов, больше митохондрий и свободных рибосом, более плотный матрикс, больше микрофиламентов около ядра, неповрежденная ядерная мембрана, гомогенный хроматин и увеличенный нуклеол. Антитело к рецептору bFGF После блокады выступы клеток исчезли, клеточная мембрана была явно разрушена, большое количество митохондрий было кавитировано, кристы исчезли, матрикс был уменьшен и дегенерировал облакообразно, эндоплазматический ретикулум был явно уменьшен до исчезновения, ядерная мембрана была явно разрушена, а некоторые клетки имели неясные структуры и были склонны к смерти. Заключение: Пролиферативный эффект bFGF на HLECs может быть блокирован антителами к рецептору FGF. Развитие помутнения задней капсулы связано с послеоперационной пролиферацией, миграцией и фиброзом эпителиальных клеток хрусталика, а изменения задней капсулы хрусталика тесно связаны с ролью факторов роста, особенно рецептора основного фактора роста фибробластов (bFGF). Блокирование рецептора FGF подавляет пролиферативный эффект bFGF на HLECs [1], и мы исследовали изменения в клеточной ультраструктуре, вызванные его действием. 1, Материалы и методы 1.1, Культура эпителиальных клеток фетального хрусталика Свежие 2 глазных яблока от одного плода, хорошо промытые физраствором, затем промытые гентамицином, помещенные в чистую стеклянную посуду, очищенные от окологлазных тканей, и отрезанная конъюнктива. Обработанные глазные яблоки хорошо промывали разбавленным раствором гентамицина, помещали в другой чистый стеклянный инкубатор, склеру вырезали по кругу примерно в 4 см от лимба роговицы на ультрачистом столе, удаляли верхнюю часть (роговица использовалась для культуры эпителиальных клеток роговицы) и удаляли хрусталик. Переднюю капсулу отделяли вдоль экваториальной части хрусталика и помещали в пластиковую посуду диаметром 27 мм со стороной клеток, обращенной ко дну, добавляли несколько капель 150 г/л культурального раствора DMEM (pH 7,2), разрезали капсулу на максимально возможное количество кусочков ножницами для радужки, раздвигали и рассеивали и помещали в камеру CO2 (MCO17AI, SANTO, Япония) примерно на 4 ч. После этого культуральный раствор осторожно пополняли примерно на 2,5 мл. Культура была продолжена (условия культивирования 37°C, 50 мл/л CO2, температура насыщения. Рост клеток наблюдали ежедневно под микроскопом, а культуральную среду меняли через 7-10 дней. Культура переливания: когда рост клеток слит, аспирируйте культуральную жидкость, промойте дважды раствором Хенкса, добавьте 2,5 г/л раствора трипсина 1,5 мл, переварите 4~8 мин аспирата, добавьте культуральную жидкость, содержащую 150 г/л FCF DMEM, многократно продуйте, чтобы сделать клетки взвешенными, опубликуйте равномерно, затем разделите на несколько культуральных блюд для продолжения культуры. 1.2. Подготовка образцов клеток Эксперименты проводились с использованием 2 поколений клеток. Нарезанные на небольшие кусочки покровные стекла стерилизовали и помещали в стеклянный культуральный сосуд диаметром 27 мм. Фетальные эпителиальные клетки хрусталика, клетки, добавленные с bFGF (100 мкг/л), и суспензии клеток, добавленные с bFGF (100 мкг/л) и антителом к рецептору bFGF (5 мг/л), капали на покровные стекла в культуральном сосуде, чтобы получить 3 различных образца, и помещали в CO2-инкубатор на 4 дня. 1.3. Получение образцов для просвечивающей электронной микроскопии Когда покровные стекла были заполнены клетками, культуральную среду отбрасывали и дважды промывали раствором Хенкса. Клетки соскабливали резиновым шпателем, супернатант удаляли после центрифугирования, фиксировали 30 г/л гаптогальдегидов, фиксировали 10 г/л осмиевой кислоты, обезвоживали этанолом шаг за шагом, встраивали методом проникания с Epon812, полимеризовали в течение 72 ч в инкубаторе при 60℃, секционировали на ультратонкой секционной машине LKBB400, дважды окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца, наблюдали и фотографировали под просвечивающим электронным микроскопом philips EM 400T. 2, Результаты 2.1, Фетальные эпителиальные клетки хрусталика Фетальные эпителиальные клетки хрусталика (2-го поколения) показали нормальные внутриклеточные митохондрии, шероховатый эндоплазматический ретикулум, свободные рибосомы и несколько микрофиламентных структур; ядерная мембрана была неповрежденной, хроматин был однородным, а количество органелл было ограничено, что говорит о том, что HLECs все еще функциональны, но имеют слабую пролиферативную способность. 2.2. Эпителиальные клетки фетального хрусталика, дополненные bFGF (100 мкг/л) Ультраструктура эпителиальных клеток фетального хрусталика, культивированных с bFGF, была следующей: клеточная мембрана была неповрежденной, с большим количеством локальных выступов в виде коротких стержней или пальцев; внутриклеточные органеллы были обильными, особенно митохондрии, которые хорошо функционировали, были значительно увеличены, матрикс также был плотным. Ядерная мембрана не повреждена, хроматин толстый и однородный, а нуклеола увеличена. Увеличение количества органелл указывало на то, что добавление bFGF оказало пропролиферативное действие на клетки, что привело к усилению метаболической функции и повышению митотической способности; в то же время это также указывало на то, что bFGF оказал определенное дифференцирующее действие на клетки, например, на микрофиламентные структуры, расположенные вдоль длинной оси, что является типичным признаком дифференцированных клеток. 2.3. Когда bFGF (100 мкг/л) и антитело к рецептору FGF (5 мг/л) были добавлены к эпителиальным клеткам фетального хрусталика, ультраструктура клеток показала исчезновение клеточных выступов, очевидное разрушение мембраны, массивную вакуолизацию митохондрий, исчезновение крист, уменьшение матрикса, облакоподобную дегенерацию, очевидное уменьшение или даже исчезновение эндоплазматического ретикулума, только несколько микрофиламентов и сломанные клетки. Клеточные органеллы были явно уменьшены и разрушены, некоторые из них исчезли; ядерная мембрана была явно разрушена; некоторые клетки были структурно нечеткими и даже имели тенденцию к гибели, предполагая, что рецепторы bFGF были антагонизированы антителами в эксперименте по нейтрализации антител, в результате чего эффект bFGF исчез, а клеточный метаболизм в основном исчез и имел тенденцию к гибели. Эпителий хрусталика — единственная клетка в хрусталике, которая содержит более обильные органеллы, и его среда также отличается от других эпителиальных клеток, которые играют важную роль в поддержании метаболизма хрусталика. В то время как эпителиальные клетки в центре передней капсулы относительно статичны, эпителиальные клетки на экваторе пролиферируют и распространяются к переднему и заднему полюсам хрусталика, постепенно дифференцируясь в фибробласты хрусталика и формируя многослойную структуру хрусталика, с такими изменениями, как удлинение тела клетки и уменьшение органелл в ходе этого процесса. В литературе сообщается, что электронная микроскопия хрусталика показывает, что передняя капсула и экваториальная капсула плотно соединены с клетками хрусталика, в то время как задняя капсула тоньше и не имеет клеточной структуры. Наличие большого количества микроворсинок в эпителии хрусталика увеличивает площадь поверхности клеток, обеспечивая место для обмена материалом между этой частью клетки и предсердной жидкостью, и, следовательно, ускоряя процесс обмена материалом между волокнами хрусталика и предсердной жидкостью. Митохондрии, которые в хорошо функционирующих клетках имеют палочковидную или яйцевидную форму, более многочисленны и могут становиться зернистыми или сливаться в более крупные скопления при плохом функционировании или метаболизме; микротрубочки и микрофиламенты образуют цитоплазматический скелет и, помимо поддержания морфологии клетки и связанной с ней подвижности, влияют на движение клеточных мембран, например, при фагоцитозе и иммунных реакциях. В целом, удлиненные клетки, ставшие фиброзными, по-разному реагируют на bFGF, и также показано, что удлинение клеток соответствует ранней активности фиброзной дифференцировки. Когда катаракта возникает под задней капсулой, периферический эпителий хрусталика мигрирует в заднем направлении, образуя несколько слоев пестрых, набухших клеток и некоторые вытянутые клетки, когда обильная капсулоподобная строма накапливается под клетками и между ними, наряду с важными изменениями в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме, комплексе Гольджи, микрофиламентах и видимых складках капсулы и апоптотических клетках; это имеет некоторое отношение к аналогичным изменениям в помутнении задней капсулы после хирургии катаракты . В отличие от этого, недавние исследования переднего капсульного помутнения дали схожие результаты. В этом эксперименте добавление bFGF привело к увеличению количества органелл, что указывает на пропролиферативное воздействие на клетки, которое привело к усилению метаболической функции и повышению митотической способности. В тех же условиях, когда bFGF был добавлен вместе с антителами к рецептору FGF, органеллы были значительно уменьшены и разрушены, некоторые исчезли, ядерная мембрана была явно разрушена, некоторые клетки были структурно неразличимы и даже имели тенденцию к гибели, предполагая, что рецептор bFGF был антагонизирован антителами в эксперименте по нейтрализации антител, в результате чего эффект bFGF исчез, метаболизм клеток в основном исчез и они имели тенденцию к гибели. Рецептор фактора роста фибробластов состоит из внеклеточной области лиганда, спиральной трансмембранной области и внутриклеточной области. 48 изоформ рецептора могут генерироваться четырьмя генами рецептора FGF. Экспрессия fGFR1 снижается с возрастом в эпителиальных клетках хрусталика, но усиливается под действием FGF и играет важную роль в развитии клеток и фиброзе. Блокирование рецептора FGF, каким бы то ни было способом, подавляет пролиферацию клеток хрусталика. Электронная микроскопия выявила экспериментальные доказательства того, что bFGF играет важную роль в поддержании капсульной мембраны эпителиальных клеток хрусталика. Пролиферативный эффект bFGF на клетки хрусталика опосредован его связыванием с рецептором FGF через сигнальную систему MAPK/ERK. bFGF и его рецептор играют важную роль в пролиферации и дифференциации эпителиальных клеток хрусталика. Наши результаты подтверждают пропролиферативный эффект bFGF на HLECs и тот факт, что этот эффект может быть блокирован антителами к его рецептору, и косвенно свидетельствуют о том, что bFGF оказывает свое биологическое действие через связывание с рецептором на поверхности клетки. Это создает основу для проведения экспериментов in vivo с целью выяснения роли bFGF и теории «связывания рецепторов» на молекулярном уровне.