Вирус гепатита В (ВГВ) является одним из наиболее распространенных вирусов в современном мире. ВГВ отличается высокой вариабельностью, что связано с тем, что ВГВ реплицируется через промежуточную РНК (прегеномную РНК), которая подвергается обратной транскрипции в отрицательно заряженную ДНК с помощью собственной ДНК-полимеразы вируса — ДНК-П. Во время обратной транскрипции ДНК-П не обладает активностью фермента коррекции и не может исправлять нуклеотидные несоответствия, что приводит к изменению последовательности ВГВДНК. HBVDNA содержит как минимум четыре открытые рамки считывания (ORF), а именно S-область (включая S-область, пре-S1-область и пре-S2-область), C-область (включая C-область и пре-C-область), P-область и X-область. В данной статье рассматриваются последние научные достижения в области лекарственной устойчивости ВГВ и стратегии профилактики. HBV — гепатофильный ДНК-вирус с длиной гена всего 3,2 кб. Внутри оболочки HBV геном HBV существует в виде неполной двухцепочечной циркулярной ДНК. РНК-полимераза хозяина использует кцДНК в качестве шаблона для транскрипции мРНК, которая также является прегеномной РНК. Мультимераза HBV использует прегеномную РНК в качестве шаблона для обратной транскрипции отрицательно-полосатой ДНК HBVDNA, а затем использует отрицательно-полосатую ДНК в качестве шаблона для синтеза положительно-полосатой ДНК HBV. Это очень важная роль для репликации HBV. Определение и номенклатура лекарственно-устойчивых мутаций HBV подразделяются на фенотипическую резистентность и генотипическую резистентность. Фенотипическая резистентность относится к повышению уровня вируса во время лечения, обычно измеряемого концентрацией противовирусных препаратов (IC50), что указывает на снижение чувствительности к препаратам или повышение лекарственной устойчивости, требующей более высоких доз препаратов для подавления мутировавшего вируса. Генотипическая устойчивость относится к мутациям в гене вирусной полимеразы, приводящим к появлению новой последовательности вирусных генов, и обычно измеряется с помощью секвенирования ДНК и генных микрочипов. Мутировавшие вирусы могут часто изменять свои биологические свойства, что создает ряд проблем для клинического лечения. Устойчивость HBV можно разделить на фенотипическую, генотипическую и клиническую. Клиническая устойчивость означает клиническое проявление вирусной репликации, которую невозможно подавить, или повторное появление ДНК HBV после того, как репликация HBV была подавлена на некоторое время, сопровождающееся повышением уровня АЛТ. ВГВ делится на восемь генотипов (от А до Н). Длина мультимеразы HBV варьируется между генотипами. Полипептид HBV можно разделить на четыре функциональные области: терминальный белок, спейсер, обратная транскриптаза и РНКаза Н. Варианты HBV с лекарственной устойчивостью основаны на принятом в мире аминокислотном варианте «одна буква плюс». Варианты HBV с лекарственной устойчивостью маркируются принятыми в международной практике буквами аминокислот плюс участки вариантов. Например, YMDD представляет четыре аминокислоты области обратной транскриптазы (тирозин-метионин-аспартат-аспартат), где изменение метионина (М) на лейцин (V) или изолейцин (I) вызывает устойчивость к ламивудину. Первоначально расположение мутации устойчивости к HBV начинается с первого аминокислотного номера полиморфного фермента HBV. Поскольку длина мультимеразы HBV варьируется между восемью генотипами HBV, YMDD располагается в разных местах, используя различные генотипы HBV в качестве эталона. Об одном и том же варианте YMDD сообщалось под разными обозначениями, такими как M552V, M550V и M539V. Чтобы избежать путаницы, Stuyverg et al. предложили стандартизировать мутации лекарственной устойчивости HBV по номеру первой аминокислоты функциональной области обратной транскриптазы (344 аминокислоты для всех генотипов) с префиксом rt (например, вариант YMDD был назван rtM204V). Поликомбовая область обратной транскриптазы HBV содержит семь субрегионов удержания генов (от A до G). Трехмерная структура полимутазной обратной транскриптазы HBV напоминает полураскрытую правую руку. Мутации rtM204V или rtM204I являются прямой причиной резистентности к ламивудину. С точки зрения молекулярной структуры, и V, и I имеют дополнительную β-метильную группу по сравнению с М. Эта дополнительная метильная группа вызывает устойчивость к ламивудину. Эта дополнительная метильная группа вызывает перегруженность пространства в сайте связывания ламивудина, что не позволяет ламивудину эффективно связываться с полимутазой ВГВ. Механизм лекарственно-устойчивых мутаций в HBV Поскольку процесс репликации HBV в естественных условиях требует обратной транскрипции, ДНК-P не обладает активностью фермента коррекции и не может исправить нуклеотидные несоответствия во время обратной транскрипции, что приводит к мутациям в последовательности HBVDNA, и естественная частота ошибок при репликации HBV примерно в 10 раз выше, чем у других ДНК-вирусов. Естественная вариация гена HBV в процессе репликации приводит к образованию квазивидов — группы генетически сходных, но не идентичных вирусных штаммов у пациентов, инфицированных HBV. Штаммы HBV дикого типа составляют большинство квазивидов у пациентов, не получающих лечение нуклеозидными аналогами. Лекарственно-устойчивые варианты могут появляться до или во время приема препаратов. Чувствительные к лекарствам штаммы дикого типа подавляются после лечения пациента. Штаммы, содержащие лекарственно-устойчивые мутации, получают больше пространства для репликации. Когда штамм с лекарственной устойчивостью становится доминирующим в квазивиде, лекарство теряет свою эффективность. Нуклеозидные аналоги, используемые для лечения гепатита В, подавляют репликацию вируса гепатита В, конкурируя с естественным субстратом (dNTP) полимутазы вируса гепатита В, чтобы подавить активность полимутазы вируса гепатита В. Регион Р — самый большой ORF в геноме ВГВ длиной 2496 п.н., кодирующий 832 аминокислотный полипептид, известный как полипептидаза HBVDNA (DNAP), расположенный между nt2357 и 0-1621. Изменения в лекарственно-устойчивых штаммах ВГВ происходят в области rt гена DNAP. Клинические исследования выявили различные лекарственно-устойчивые штаммы HBV, и имеющиеся препараты можно разделить на три группы в соответствии с различными формами штаммов, устойчивых к нуклеозидным (кислотным) аналогам. (2) Ациклическая фосфатная группа, включая адефовир дипивоксил (ADV) и тенофовир (TFV); (3) Циклопентеновая группа, включая энтекавир (ETV) и др. Группа аналогов L-рибозида (кислоты) представляет собой активный сайт обратной транскрипции HBV, состоящий из тирозина (Y), метионина (M)-аспартата (D)-аспартата (D), или YMDD, который является сайтом связывания LAM для вмешательства в репликацию HBV. Этот сайт является местом связывания LAM для вмешательства в репликацию HBV. Вариант YIDD может существовать отдельно, тогда как YVDD часто сопровождается вариантом, в котором лейцин (L) на rt180 в области B полиморфазы заменен на метионин (M). YVDD часто сопровождается заменой лейцина (L) на метионин (M) в области B полимеразы. Эта мутация значительно снижает чувствительность HBV к LAM. Основной сайт мутации устойчивости, связанный с ламивудином, — rtM204I/V. В современных исследованиях были выявлены различные типы мутантных форм, связанных с устойчивостью, включая: (1) r t M 2 0 4 I / V + rtL180M; (2) rtM204I; (3) rtV173L + rtL180M + rtM204V; (4) r1L80I + rtM204I; ( (5) rtQ215S + rtM204I/V + rtL180M; (6) rtIl69T + rtV173L + rt 180M + rtM204V; (7) rtA181T; (8) rtT184S + rtM204I/V ± rtL180M; (9) rtM204S + rtL180M. Некоторые из этих мутаций являются как компенсаторные мутации могут усиливать активность вирусной репликации или лекарственную устойчивость, а часть вариантов может влиять на последующий выбор лечения. Другие аналоги L-нуклеозида (кислоты) имеют характеристики резистентности, схожие с таковыми у ламивудина, при этом основной сайт мутации сосредоточен на rtM204I/V и сопровождается некоторыми другими вариантами сайтов. В отличие от устойчивости к ламивудину, которая в основном сосредоточена на rtM204, варианты устойчивости к адефовиру более разбросаны, и в дополнение к двум вышеуказанным вариантам были также обнаружены rtP237H, rtN238T/D, rtV84M, rtS85A, rtQ85A и rtV84M. rtP237H, rtN238T/D, rtV84M, rtS85A, rtQ215S и rtV214A. T F V эффективен против штаммов, устойчивых к ламивудину, однако у пациентов, совместно инфицированных H I V и H B V, были обнаружены мутации, устойчивые как к T F V, так и к ламивудину. Однако у пациентов, совместно инфицированных H I V и H B V, был обнаружен штамм, устойчивый как к T F V, так и к ламивудину, с мутацией, расположенной в сайтах связывания B- и C-регионов rtA194T и с мутацией rtL180M+rtM204V. Этот комбинированный мутант имеет более чем 10-кратное снижение восприимчивости к TFV. 3. Циклопентеновая группа Существует две основные формы мутаций устойчивости к энтекавиру, обе встречаются у пациентов, устойчивых к ламивудину, (1) rtM250V ± rtI169T + rtM204V + rtL180M, (2) rtT184G + rtS202G/I + rtM204V + rtL180M. Недавно была обнаружена мутация rtV173L. V. Профилактика и лечение лекарственной устойчивости ВГВ 1. Предсказатели вариантов лекарственной устойчивости вируса гепатита В: Различные факторы могут предсказать вероятность устойчивости ВГВ к аналогам нуклеозидов (кислот). Например, высокая нагрузка ДНК HBV в начале лечения, наличие фиброза/цирроза печени, предыдущее противовирусное лечение нуклеозидным аналогом и высокая адаптационная способность резистентного штамма вируса указывают на высокий риск развития резистентности. Все большее число исследований свидетельствует о том, что ранний вирусологический ответ также является важным предиктором частоты возникновения лекарственной устойчивости. (1) Рациональный выбор аналогов нуклеозидов (кислот) для противовирусной терапии: аналоги нуклеозидов (кислот) не рекомендуются пациентам с иммунной толерантностью или неактивной инфекцией HBV, особенно в молодых возрастных группах, которые не нуждаются в иммуносупрессивных или химиотерапевтических препаратах. ( 2) Рациональный выбор схемы противовирусного лечения: схему лечения см. в китайском «Руководстве по профилактике и лечению хронического гепатита В». Необходимо тщательно следить за вирусологическим ответом пациента во время лечения. Кроме того, следует максимально избегать последовательной терапии одним препаратом, чтобы избежать развития множественной лекарственной устойчивости. (3) Повышение комплаентности пациентов: во время противовирусного лечения аналогами нуклеозидов (кислот) следует уделять особое внимание своевременному приему препаратов в адекватных дозах, назначенных врачом. (3) Регулярный мониторинг ответа и своевременная корректировка схемы лечения: во время лечения следует каждые 3 месяца проводить анализ уровня HBVDNA, а при первичной неудаче лечения или вирусологическом прорыве следует незамедлительно проводить генотипическое тестирование на резистентность, если это не связано с плохим соблюдением режима лечения, а также выявлять модели отклонений для перехода на другие схемы лечения. Однако при анализе результатов важно учитывать, что чувствительность разных лабораторий и разных методов тестирования может отличаться. Рекомендуется клиническое ведение пациентов с лекарственно-устойчивыми мутациями: для небольшого числа пациентов с нормальным уровнем АЛТ до лечения и легкими воспалительными или фиброзными поражениями печени (< G1S1) противовирусная терапия может быть прекращена, но необходим тщательный мониторинг для своевременного возобновления противовирусной терапии в случае обострения гепатита; для большинства пациентов с устойчивостью к нуклеозидным (кислотным) аналогам, особенно с декомпенсированным циррозом, требуется ранняя восстановительная терапия. Большинство пациентов с устойчивостью к нуклеозидным (кислотным) аналогам, особенно при декомпенсированном циррозе, нуждаются в ранней восстановительной терапии. Обычно вирусологический прорыв предшествует биохимическому прорыву, и спасательная терапия до биохимического прорыва может спасти пациентов от вспышек гепатита и прогрессирования заболевания печени. Восстановительная терапия требует добавления или замены нуклеозидного аналога без перекрестной устойчивости, в зависимости от устойчивости вируса к различным нуклеозидным аналогам; если нет противопоказаний, можно использовать IFN2α или пегилированный интерферон. Добавить адефовир или перейти на энтекавир при устойчивости к ламивудину; добавить ламивудин или перейти на телбивудин или энтекавир для пациентов с устойчивостью к адефовиру и начальным лечением ламивудином; лечить устойчивость к телбивудину так же, как и к ламивудину; добавить адефовир или перейти на ИФНα при устойчивости к энтекавиру. VI. Методы выявления вариантов ВГВ Основными методами выявления вариантов ВГВ являются 1. ПЦР-анализ полиморфизма с рестрикционным ферментным срезом (ПЦР-RFLP) в настоящее время является широко используемым методом для выявления вариантов YMDD, устойчивости к адефовиру rtA181V и участков вариантов региона BCP в отечественных лабораториях. Амплификация флуоресцентной ПЦР в реальном времени является более недавно используемым методом для выявления лекарственной устойчивости ВГВ в Китае. 2, анализ генного чипа, включая технологию жидкого чипа, технологию гибридизации зонда, в основном с помощью технологии обратной гибридизации speckle для достижения обнаружения сайтов вариантов. 3.Пирофосфатное секвенирование, проверка воспроизводимости и надежности образцов сыворотки показали, что частота обнаружения мутаций и воспроизводимость стандартов плазмиды составляет 100%, а образцов сыворотки - 98,8%. 4. клонирование и секвенирование генов, специфические праймеры использовались для клонирования и секвенирования целевого фрагмента и определения места мутации путем сравнения со стандартным штаммом. Это наиболее объективный из всех методов обнаружения, но основным недостатком этого метода является его сложность, высокая стоимость и трудоемкость. HBV обладает высокой скоростью репликации, и, по оценкам, среднее количество частиц вируса H B V, производимых в день, составляет 1012-13, при этом одно несоответствие происходит каждые 10 5 нуклеозидов в цикле репликации. Изменчивость HBV настолько высока, что ни один из двух штаммов вируса не имеет идентичных нуклеотидных последовательностей. HBV подвергается превосходному отбору на мутации под влиянием таких факторов, как хроничность инфекции, иммунный ответ, вакцинация и терапия вирусными препаратами для достижения выживания вида. Недавние исследования показали, что иммунное давление хозяина играет важную роль в генерации и отборе мутаций в гене HBV. В заключение следует отметить, что мутации HBV оказывают большое влияние на диагностику, лечение и профилактику гепатита В, а мутации, возникающие в каждой ORF при персистирующей инфекции HBV, не единичны и могут происходить в нескольких локусах. В настоящее время исследователи успешно расшифровали новые гены, кодирующие геном HBV - гены pre-pre-S и pre-X. Это позволило увеличить количество ORF в геноме HBV до шести. Кроме того, геном HBV включает ряд других регуляторных элементов, участвующих в вирусной репликации, в том числе четыре промотора, два энхансера, упаковочный сигнал ε и т.д. Поэтому к вариантам HBV необходимо подходить с точки зрения всего генома, с учетом развития вариантов HBV и анализировать их со всех сторон, чтобы правильно проанализировать заболевание и избежать клинической недодиагностики, слепого применения лекарств и запоздалого лечения, которое может усугубить состояние пациента. Только при правильном подходе к вариациям точек HBV можно судить о выборе противовирусных препаратов и прогнозе заболевания, что создает основу для индивидуального подхода к лечению пациентов.