215007 Институт заболеваний печени, Пятая народная больница Сучжоу, Сучжоу, Китай (Tong Fuyi Wu Jianhong Cao Wengui Wu Xingfu Fei Xiaofeng Ding Longqi)
[Аннотация] Цель: Изучить взаимосвязь между маркерами вируса гепатита В (HBV-M) и нагрузкой HBV (HBV-DNA), а также создать научную основу для правильной клинической диагностики и лечения. Методы: HBV-M и HBV-ДНК были определены в сыворотках 670 пациентов методами иммунолюминесценции и флуоресцентной количественной полимеразной цепной реакции, соответственно. результаты: HBeAg-положительный режим HBV-DNA > 5,0e4 cps/ml составил 96,3% (363/377), HBeAg-отрицательный режим HBV-DNA > 5,0e4 cps/ml составил HBV-DNA load был значительно выше в HBeAg-положительной картине, чем в HBeAg-отрицательной (P < 0,05). Нагрузка HBV-ДНК была значительно выше при схеме 1,3,5, чем при схеме 1,4,5 (P < 0,01). 18,8% (12/64), а среди анти-HBs положительных схем, HBV-ДНК >5,0e4 cps/ml составила 16,7% (7/42). Выводы: Нагрузка HBV-ДНК была значительно выше при HBeAg-положительной модели, чем при HBeAg-отрицательной. Однако у нескольких HBeAg-положительных пациентов уровень вируса был очень низким, а у HBeAg-отрицательных — высоким. Существуют также HBsAg-отрицательные или/и анти-HBs-положительные HBV-инфекции. Поэтому только сочетание тестирования HBV-M и нагрузки HBV может правильно определить заболевание и прогноз в клинической практике. Тун Фуйи, отделение гепатологии, Пятая народная больница Сучжоу, Сучжоу, Китай
[Ключевые слова] вирус гепатита В; полимеразная цепная реакция; флуоресцентная количественная оценка; иммуноферментный анализ.
Взаимосвязь между моделями серологических маркеров и количеством вируса у пациентов, инфицированных вирусом гепатита В
Тонг Фуйи, Шаовэй, Цао Венгуй и др. Отделение инфекционных болезней, Пятая народная больница Сучжоу, Сучжоу 215007
[Аннотация] Цель Понять взаимосвязь между моделями серологических маркеров и количеством вируса гепатита В (HBV). Методы Серологические маркеры HBV у 670 пациентов были определены с помощью иммуноферментного анализа, а количество HBV у них было измерено с помощью Результаты HBeAg-положительные пациенты, чьи копии превышали 5,0e4 /ml, составили 96,3%, а копии HBV у HBeAg-положительных пациентов были значительно больше, чем у HBeAg-отрицательных пациентов, чьи копии превышали 5,0e4 /ml, составили 74,8%. Копий HBV у HBeAg-положительных пациентов было значительно больше, чем у HBeAg-отрицательных пациентов (P < 0,05). Копий HBV у анти-HBe-положительных пациентов было значительно меньше, чем у анти-HBe-отрицательных пациентов (P < 0,01). HBV-ДНК была обнаружена у некоторых HBsAg-отрицательных (анти-HBs-положительных или нет) пациентов.Выводы Копий HBV у HBeAg-положительных пациентов было значительно больше, чем у HBeAg-отрицательных Однако у некоторых HBeAg-положительных пациентов количество копий HBV очень низкое, а у некоторых HBeAg-отрицательных пациентов - HBV-ДНК даже может быть обнаружена у некоторых HBsAg-отрицательных (анти-HBs-положительных или нет) пациентов. О точном прогнозе помогает судить анализ серологических маркеров и количества вируса. О точном прогнозе помогает судить анализ серологического маркера и количества вируса. Количественная ПЦР (Q-PCR) стала реальностью благодаря скачку вперед в технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР) в последние годы. Мы использовали метод флуоресцентной количественной полимеразной цепной реакции (FQ-PCR) для выявления HBV-DNA в 670 случаях HBV-инфицированных пациентов, чтобы изучить взаимосвязь между HBV-M и нагрузкой HBV. 1 Данные и методы 1.1 Сбор случаев: 670 случаев - это все стационарные пациенты нашей больницы с января по октябрь 2002 года. Все пациенты не использовали специальные противовирусные препараты, такие как интерферон, ламивудин, α1-тимидин и т.д. в течение последних 3 месяцев. Собиралась периферическая кровь, выделялась сыворотка и исследовалась в тот же день или хранилась при -20°C. 1.2 Определение HBV-M: автоматизированный иммунолюминесцентный диагностический прибор AXSYMTM фирмы Abbott (США), с реагентами, предоставленными фирмой Abbott в качестве вспомогательных реагентов, под управлением специального персонала. Положительный режим отчетности: HBsAg (S/N) ≥ 2,00; анти-HBs (Miu/ml) ≥ 10,00; HBeAg (S/CO) ≥ 1,00; анти-HBeAg (S/CO) ≤ 1,00; анти-HBc (S/CO) ≤ 1,00. 1.3 Количественное определение HBV-ДНК: Использовался метод количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени. Использовался полностью автоматизированный прибор количественной ПЦР AcuGen System TMAG 9900 QRM Guantitation RoboMaster, реагенты - вспомогательные реагенты AcuGen System, предоставленные компанией Shenzhen Baiyaktai (Biotronics). Чувствительность обнаружения составляла 5,0e4cps/мл. 1.4 Статистическая обработка: для сравнения показателей использовался тест χ2. 2 Результаты 2.1 Данные по случаям: всего 670 пациентов, 515 мужчин и 155 женщин. Соотношение мужчин и женщин составило 3,3:1, возраст варьировался от 7 до 72 лет, из которых 89,6% были в возрасте 15-60 лет (600/670). 2.2 Модели HBV-M: Было обнаружено 14 моделей HBV-M. 8 HBsAg-положительных моделей составили 591 случай, что составляет 88,2% от общего числа случаев (591/670), из которых 1,3,5 модели составили 50,3% (297/591) и 1,4,5 модели составили 30,6% (181/591). 6 HBsAg-отрицательных паттернов составили 64 случая, что составило 9,6% (64/670) от общего числа случаев, включая 34,4% (22/64) для паттерна 2,4,5, 23,4% (15/64) для паттерна 4,5 и 21,9% (14/64) для паттерна 2,5. 15 случаев были полностью отрицательными на HBV-M. Таблица Взаимосвязь между HBV-M и нагрузкой HBV-ДНК Таблица 1 Взаимосвязь между маркером вируса гепатита В и количеством ДНК вируса гепатита В Маркер вируса гепатита В Количество случаев HBV-ДНК нагрузка количество HBV (cps/ml) маркер HBV n ＜5.0e4(%) 5.0e4~4.9 e6(%) 5.0 e6~4.9 e8(%) ＞5.0 e8(%) (-) (+) (++) (+++) 1,3,5 297 8(2.7) 69(23.2) 124(41.8)△ 96(32.3)▲ 1,4,5 181 46(25.4) 67(37.0) 55(30.4)△ 13(7.2)▲ 1,3,4,5 67 4(6.0) 20(29.9) 35(52.2) 8(11.9) 1,5 23 6(26.1) 10(43.5) 4(17.4) 3(13.0) 1,2,3,5 11 1(9.1) 3(27.3) 4(36.4) 3(27.3) 1,2,4,5 9 1(11.1) 4(44.4) 3(33.3) 1(11.1) 1,2,3,4,5 2 1(50.0) 1(50.0) 1 1 1(100.0) 2,4,5 22 18(81.8) 3(13.6) 1(4.5) 2,5 14 12(85.7) 2(14.3) 2 5 4(80.0) 1(20.0) 2,4 1 1(100.0) 4,5 15 12(80.0) 1(6.7) 2(13.3) 5 7 5(71.4) 2(28.6) Отрицательные 15 14 14(93.3) 1(6.7) Всего 670 132 186 226 126 * 1: HBsAg, 2: анти-HBs, 3: HBeAg, 4: анти-HBe, 5: анти-HBc. △: P < 0.05; ▲: P < 0.01 2.3 Нагрузка HBV: среди HBsAg-положительных моделей: HBeAg-положительная модель HBV-ДНК > 5,0e4cps/мл составила 96,3% (363/377), анализ HBeAg-отрицательной модели HBV-ДНК > 5,0e4cps/мл составил 74,8% (160/214). Нагрузка HBV-ДНК была значительно выше при HBeAg-положительном паттерне, чем при HBeAg-отрицательном (χ2=6,07, P<0,05). Для паттернов 1,3,5, HBV-ДНК <5,0e4cps/ml составляла только 2,7%, в то время как HBV-ДНК >5,0e4cps/ml составляла 97,3% (289/297), из которых HBV-ДНК >5,0e6cps/ml составляла 41. 8% (124/297) и HBV-DNA >5.0e8cps/ml — 32.3% (96/297).1,4,5 Среди моделей, HBV-DNA <5.0e4cps/ml составила 25.4%, а HBV-DNA >5. 0e4cps/ml составили 74,6% (135/181), из которых HBV-DNA >5,0 e6 cps/ml составили 30,4%, а HBV-DNA >5,0e8 cps/ml составили только 7,2%. Нагрузка HBV-ДНК была значительно выше в 1,3,5 паттернах, чем в 1,4,5 паттернах (P < 0.01). e8 cps/ml; HBV-ДНК <5.0e4 cps/ml составила 83.3% (35/42) анти-HBs положительных паттернов. В 2 случаях одновременно присутствовали 5 маркеров HBV-M. (см. таблицу) 3 Обсуждение HBV-M может проявляться в различных формах после инфицирования HBV. Результаты данного исследования выявили 14 антигенных паттернов антител. Наиболее распространенным паттерном HBsAg-позитивности был паттерн 1,3,5 (43,0%). Среди HBsAg-негативных паттернов наиболее распространенными были 1,5 (29,1%) и 2,4,5 (27,8%), затем 4,5 (19,0%) и 2,5 (17,7%). И в 2 случаях был выявлен положительный результат на HBV-M. HBeAg является экспрессией мРНК пре-С/С области генома HBV и тесно связан с HBV-ДНК, поэтому обычно HBeAg-положительные люди имеют активную вирусную репликацию и являются высокоинфекционными, в то время как HBeAg-отрицательные люди имеют низкий уровень вирусной репликации и менее инфекционны. Результаты нашего исследования также подтвердили, что уровень HBV-ДНК у HBeAg-положительных пациентов был значительно выше, чем у HBeAg-отрицательных (P < 0,05). Это согласуется с большинством сообщений [1]. Однако в HBeAg-положительной картине все еще было 3,7% пациентов с HBV-ДНК <5,0e4 cps/ml, что может быть связано с подавлением репликации HBV под сильным иммунным давлением организма или из-за интеграции HBV-ДНК в крови в гепатоциты. При HBeAg-негативной картине все еще есть 74,8% пациентов с HBV-ДНК > 5,0e4 cps/ml и даже 7,2% пациентов с HBV-ДНК > 5,0e8 cps/ml, что может быть связано с мутациями гена HBV, особенно когда мутирует ген pre-C или промотор гена C, антиген e трудно экспрессировать, а вирусная репликация все еще присутствует [2,3].
Исчезновение HBsAg и выработка анти-HBs в основном подразумевает восстановление HBV-инфекции или защитный эффект вакцинации организма против гепатита В. Результаты данного исследования показали, что в HBsAg-негативной, анти-HBs положительной картине, все еще есть 16,7% пациентов с HBV-ДНК > 5,0e4 cps/ml, только уровень вируса в основном не высок, что может быть связано с низким уровнем вирусной репликации.HBsAg-негативная HBV-инфекция является горячей точкой клинической озабоченности в течение нескольких лет. Причинами этого являются: (i) количество антигена слишком мало, чтобы достичь обнаруживаемого уровня; (ii) он существует в виде комплекса антиген-антитело, и когда антитела преобладают, антиген маскируется и набор не чувствителен и не может быть обнаружен; (iii) варианты гена HBV-S, в которых некоторые варианты в основной гидрофильной области не производят HBsAg [4]. Это может быть связано с мутациями в гене S, кодирующем HBsAg: кластер детерминант «a» гена S является основным кластером антигенных детерминант, и одна консервативная аминокислотная замена в этой области может изменить антигенность HBsAg. Вариации в кластере детерминант «а» влияют на общий ответ антител. HBsAg обнаруживается обычными иммунодиагностическими реагентами, а анти-HBs, вырабатываемые организмом, не могут нейтрализовать мутировавший HBV, и существуют различные подтипы HBV с географическим распределением и полиморфизмом в последовательности кластера детерминант «a» [5]. В нашем исследовании мы обнаружили, что HBsAg отрицательные и/или анти-HBs положительные пациенты имели HBV инфекцию в небольшом количестве сывороток, а титры HBsAg и HBeAg коррелировали с уровнями HBV-ДНК [6]. уровни коррелировали [6]. уровни коррелировали [6]. Кроме того, результаты теста на анти-HBs могут быть связаны не только с источником реагентов, но и с различиями в источнике полученной вакцины против гепатита В [7].
Процесс вирусной репликации также сопровождается экспрессией упаковочных белков, и эти гетерологичные белки (антигены) стимулируют иммунную систему организма к выработке соответствующих антител. Таким образом, антигенные антитела отражают уровень вирусной экспрессии и, косвенно, уровень вирусной репликации. Серологические методы также могут быть использованы для анализа этиологии гепатита В (этиологическая диагностика), инфекционности, развития заболевания и прогноза. Однако на экспрессию HBV и силу иммунного ответа организма влияет ряд факторов, и возможно, что иммунологические показатели не совсем соответствуют клиническим явлениям и вирусной нагрузке [8]. В связи с широким применением ингибиторов обратной транскриптазы HBV и повсеместным распространением вирусных вариантов многие клинические явления уже не могут быть полностью объяснены только иммунологическими показателями. Серологическое тестирование не является полной заменой анализа на ДНК HBV. Вирусная нагрузка является более количественным показателем, чем серология, и может быть более точным и чувствительным, чем серологические показатели, в отражении клинических явлений и их меняющихся тенденций. Однако эти два показателя не могут полностью заменить друг друга. Поэтому клиническое тестирование HBV-M должно сопровождаться тестированием уровня HBV-DNA, и сочетание этих двух показателей может правильно определить заболевание и прогноз, если только односторонний акцент на одной стороне будет необъективным.
Ссылки
1 Kessler HH, Preininger S, Stelzl E, et al. Идентификация различных состояний вируса гепатита B
инфекции с помощью количественного анализа ПЦР. Clin Diagn Lab Immunol 2000;7:298~300
2 Hunt CM, Mcgill JM, Allen MI, et al. Клиническая значимость мутаций вируса гепатита В. Гепатология 2000; 31:1037~1044
3 Fujiwara K, Yokosuka O, Ehata T, et al. Two different states of hepatitis B virus DNA in
бессимптомных носителей: Hbe-антиген-положительные против анти-HBe-положительных бессимптомных носителей. Dig Dis Sci 1998;43:368~376
4 Luo, Anti-Sen, ed. Hepatitis B basic and clinical. 2-е изд. Пекин: Народное издательство здравоохранения, 2001, 334~335
5 Tong F.Y., Bai J.Y., Tang Y.H., et al. Исследование полиморфизма последовательности гена S вируса гепатита В в южной Цзянсу. Китайский и западный
Журнал комбинированной медицины и болезней печени, 2002;12(5):260~262
6 Shao W, Tong FY, Ruan CJ. Взаимосвязь между титрами HBsAg и HBeAg и уровнями HBV-ДНК. Гастроэнтерология и гепатология
Zhi, 2003;12(5):475~476
7 Heijtink RA, Schneeberger PM, Postma B, et al. Уровни анти-HBs после иммунизации против гепатита B зависят от тестовых реагентов: рутинно определяемые уровни серопротекции 10 и 100IU/L ненадежны.Vaccine, 2002, 20:2899~2905
8 Weston SR, Martin P. Serological and molecular testing in viral hepatitis: an update. can J.
Gastroenterol,2001,15:177~184