1 Определение
ПЦР — это экспериментальный метод молекулярной биологии для ферментативного синтеза in vitro специфических фрагментов ДНК, состоящий в основном из повторяющегося термического цикла, состоящего из трех этапов: высокотемпературной денатурации, низкотемпературного отжига и удлинения при умеренной температуре: То есть, шаблонная ДНК сначала денатурируется до одноцепочечной при высокой температуре, два праймера отжигаются до комплементарной последовательности на каждой из двух нитей шаблонной ДНК под действием ДНК-полимеразы и соответствующей температуры, затем ДНК-полимераза Отжженные праймеры затем удлиняются с помощью четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTPs) в качестве субстратов, катализируемых ДНК-полимеразой. Это повторяется таким образом, чтобы фрагмент ДНК, расположенный между двумя известными последовательностями, амплифицировался в геометрической прогрессии.
2 Исторический обзор полимеразной цепной реакции
2.1 Самая ранняя концепция амплификации нуклеиновых кислот in vitro
В 1971 году Хорана и его коллеги предложили, что «гены тРНК могут быть клонированы путем денатурирования ДНК, гибридизации ее с подходящими праймерами, удлинения праймеров с помощью ДНК-полимеразы и постоянного наблюдения за процессом». Однако ранняя идея Хораны и др. была забыта из-за сложности секвенирования и синтеза олигонуклеотидных праймеров в то время и открытия эндонуклеаз рестрикции ДНК Смитом и др. в то время (1970), что сделало возможным клонирование генов in vitro.
3.2 Изобретение полимеразной цепной реакции
Только в 1985 году Маллис и др. изобрели революционную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в лаборатории генетических исследований человека компании PE-Cetus, Inc. в США, сделав желанную неограниченную амплификацию фрагментов нуклеиновых кислот in vitro реальностью. Принцип схож с репликацией ДНК in vivo, за исключением того, что он обеспечивает подходящие условия для синтеза ДНК in vitro в пробирке. Все началось с использования фрагмента Кленова ДНК-полимеразы E. coli для амплификации специфических фрагментов генома человека. Поскольку фермент не является термостойким, фермент Кленова приходится доливать после каждого нагревания денатурированной ДНК. Этот процесс занимает много времени, трудоемок и чреват ошибками при работе с несколькими образцами. Применение термостойкой ДНК-полимеразы упростило автоматизацию полимеразной цепной реакции, и компания PE-Cetus представила первый термоциклер для полимеразной цепной реакции, сделав автоматизацию этой технологии реальностью.
3 Развитие технологий, связанных с полимеразной цепной реакцией
Развитие полимеразной цепной реакции и связанных с ней технологий было феноменальным. Первый и второй международные симпозиумы по технологии полимеразной цепной реакции были проведены в США и Великобритании в 1988 и 1990 годах, соответственно. Первый симпозиум был посвящен применению полимеразной цепной реакции и оптимизации самой технологии; второй симпозиум был посвящен проекту «Геном человека» и последним достижениям в области полимеразной цепной реакции. Это отражает то значение, которое биологи придают полимеразной цепной реакции.
(Таблица) Технологии, связанные с полимеразной цепной реакцией
Название Основное использование Метод амплификации с симплексным праймером
Амплификация неизвестных фрагментов генов
Вложенная полимеразная цепная реакция
Повышение чувствительности и специфичности полимеразной цепной реакции и анализ мутаций
Комплексная полимеразная цепная реакция
Одновременное выявление нескольких мутаций или патогенов
Обратная полимеразная цепная реакция
Амплификация неизвестных последовательностей по обе стороны от известной последовательности, вызывая мутации в продукте
Полимеразная цепная реакция с одним специфическим праймером
Амплифицирует неизвестную геномную ДНК
Односторонний праймер полимеразная цепная реакция
Амплификация неизвестной кДНК известными последовательностями
Якорная полимеразная цепная реакция
Анализ последовательностей с разными концами
Эффективная полимеразная цепная реакция
Уменьшает димеризацию праймеров и улучшает специфичность полимеразной цепной реакции
Полимеразная цепная реакция
Облегчает разделение продуктов
Мембранно-связанная полимеразная цепная реакция
Удаление загрязняющих примесей или остатков продуктов полимеразной цепной реакции
Экспрессионная кассета Полимеразная цепная реакция
Получение фрагментов ДНК для синтетических или мутантных белков
Опосредованная лигированием полимеразная цепная реакция
Анализ метилирования ДНК, мутации, клонирование и т.д.
RACE-полимеразная цепная реакция
Амплификация концов кДНК
Количественная полимеразная цепная реакция
Количественная оценка мРНК или хромосомных генов
Полимеразная цепная реакция in situ
Исследование доли клеток, экспрессирующих тот или иной ген и т.д.
Гипотетическая полимеразная цепная реакция
Идентификация бактерий или генетических эффектов
Полимеразная цепная реакция с общим праймером
Амплификация родственных генов или выявление родственных патогенов
Амплификация генов для фенотипического типирования (картирования)
Одновременный анализ мРНК из небольшого количества клеток
4 Другие методы амплификации
Параллельно с развитием полимеразной цепной реакции и связанных с ней методов были созданы новые методы амплификации. Эти методы, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки, дополняют полимеразную цепную реакцию, а некоторые из них могут быть объединены в большое семейство методов амплификации нуклеиновых кислот in vitro. Мы считаем, что с развитием технологии молекулярной биологии появятся новые члены этого семейства.
Другие методы амплификации нуклеиновых кислот in vitro (Таблица) Технические приложения Транскрипционно-зависимая система амплификации (TAS) обнаружение ВИЧ лигазная цепная реакция (LCR) обнаружение точечной мутации автономная репликация последовательности (3SR) система для изучения РНК, клинические приложения, судебная медицина и другие цепная амплификация замещения (SDA) обнаружение, идентификация гена Qβ репликазная система для повышения чувствительности обнаружения зонда круговая реакция зонда для повышения чувствительности обнаружения зонда.
4.1 Лигазная цепная реакция (A)
Лигазная цепная реакция (LCR), новая техника амплификации и детекции ДНК in vitro, в основном используется для изучения точечных мутаций и амплификации целевых генов. Она была изобретена и запатентована Бакманом в 1997 году для обнаружения точечных мутаций в последовательностях целевых генов.
Основной принцип LCR заключается в использовании ДНК-лигазы. LCR амплифицирует большое количество целевых генов путем специфического лигирования двухцепочечных фрагментов ДНК в трехэтапном цикле денатурации-отжига-соединения.
Эффективность амплификации LCR сравнима с эффективностью полимеразной цепной реакции, а для LCR с термостойкой лигазой используются только два температурных цикла: денатурация при 94°C мин и денатурация и лигирование при 65°C в течение примерно 30 циклов. Обнаружение ее продуктов также более удобно и чувствительно. В настоящее время этот метод в основном используется для изучения и выявления точечных мутаций, обнаружения микробных патогенов, направленного мутагенеза и т.д. Он также может быть использован для диагностики полиморфизмов одноосновных генетических заболеваний и продуктов одноосновных генетических заболеваний, идентификации видов микроорганизмов и изучения точечных мутаций в онкогенах.
4.2 Амплификация, зависящая от последовательности нуклеиновых кислот (А)
Амплификация на основе последовательности нуклеиновых кислот (NASBA), также известная как самоподдерживающаяся репликация последовательности (3SR) или метод регенеративной репликации последовательности, была впервые описана Гуателли и др. в 1990 году. NASBA в основном используется для амплификации, обнаружения и секвенирования РНК.
Основной метод: добавление праймеров и образцов в реакционный раствор для амплификации, открытие вторичной структуры молекулы РНК при 65℃ в течение 1 мин, затем охлаждение до 37℃ и добавление обратной транскриптазы, Т7РНК-полимеразы и РНКазы Н, и реакция при 37℃ в течение 1~1,5 ч. Продукт можно увидеть под ультрафиолетом при электрофорезе агарозы и окрашивании бромэтидием.
NASBA характеризуется простотой эксплуатации, отсутствием специального оборудования и температурных циклов. Весь процесс реакции контролируется тремя ферментами, с меньшим количеством циклов и высокой точностью, а эффективность амплификации выше, чем у полимеразной цепной реакции, с хорошей специфичностью.
4.3 Транскрипционно-зависимая система амплификации (А)
Транскрипционно-зависимая система амплификации (TAS), о которой сообщили Квен и др. в 1989 году, в основном используется для амплификации РНК.
Главной особенностью TAS является высокая эффективность амплификации, поскольку число копий РНК экспоненциально увеличивается на 10, достигая 2×106 копий целевой последовательности всего за 6 циклов. Другой особенностью является высокая специфичность, поскольку TAS может выполнять только 6 температурных циклов с низкой скоростью смешивания, в сочетании с гибридизацией с сэндвичем из декстрановых бусин.
Хотя этот метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью, его процесс циклирования сложен и требует многократного добавления обратной транскриптазы и полимутазы Т7РНК, что требует дальнейшего изучения.
4.4 Реакция Qβ-репликазы (A)
Качиан и др. впервые сообщили в 1972 году, что Qβ-репликаза (Q-бета-репликаза) катализирует функцию саморепликации РНК-шаблона, которая может усиливать природный шаблон MDV-1 РНК до 109 при комнатной температуре в течение 30 минут. В 1986 году Чу и др. сообщили, что с помощью специфического зонда с биотеггированной целевой последовательностью, который может гибридизоваться с аффинно связанной РНК MDV-1 В 1986 году Чу и др. сообщили, что специфический зонд с биотеггированной целевой последовательностью может использоваться для гибридизации с аффинно связанной РНК MDV-1, которая элюируется из несвязанного MDV-1, после чего добавляется Qβ-репликаза для усиления копий MDV-1, а затем детектируется окрашиванием бромистым этидием или гибридизуется с гомологичным вторым зондом.
Репликаза Qβ — это РНК-направленная РНК-полимераза, обладающая 3 особенностями: ① Она может инициировать синтез РНК без олигонуклеотидного праймера. (ii) Она может специфически распознавать уникальную структуру складывания РНК в РНК-генах благодаря внутримолекулярному сопряжению оснований. (iii) Вставка короткой последовательности нуклеиновой кислоты в развернутую структурную область РНК MDV-1, естественного шаблона Q β-репликазы, не влияет на репликацию фермента. Таким образом, если в эту область вставить зонд из нуклеиновой кислоты, его последовательность также может быть амплифицирована Qβ-репликазой.
В 1988 году Lizardi и др. вставили последовательность целевого гена в плазмиду MDV-1 и транскрибировали РНК-зонд MDV-1, катализируемый РНК-полимеразой T7, которая могла гибридизоваться с целевой последовательностью, затем промыли негибридизованный зонд и добавили Qβ-репликазу для амплификации зонда, и амплифицированный зонд можно было использовать в качестве шаблона для экспоненциальной амплификации. Продукт обнаруживается двумя вышеописанными методами. Сейчас в технике развиты сэндвич-гибридизация, молекулярный переключатель и мишень-зависимая репликация.
5 Примеры применения методов полимеразной цепной реакции.
Исследование: клонирование генов; секвенирование ДНК; анализ мутаций; рекомбинация и слияние генов; идентификация и регуляция последовательностей ДНК конъюгации белков; картирование сайтов вставки транспозонов; обнаружение модификаций генов; конструирование синтетических генов; конструирование клонирующих или экспрессионных векторов; обнаружение эндонуклеазного полиморфизма гена.
Диагностика: бактерии (спирохеты, микоплазма, хламидии, микобактерии, риккетсии, дифтерия, патогенная кишечная палочка, дизентерия, Aeromonas hydrophila и Clostridium difficile и др. ); вирусы (HTLV, ВИЧ, HBV, HPVS, EV, CMV, EBV, HSV, вирус кори, ротавирус, B19 микровирус); паразиты (малярия и др.); генетические заболевания человека (синдром Леша-Нихана, геодистрофия, гемофилия, ВМД, МДД, муковисцидоз и др.)
Иммунология: расщепление HLA; характеристика диверсификации Т-клеточных рецепторов или антител; генетическое картирование аутоиммунных заболеваний; количественное определение лимфокинов
Геномная инженерия человека: генерация сигнатур ДНК с рассеянными повторяющимися последовательностями; построение генетических карт (выявление ДНК, полиморфизмов или картирование сперматозоидов); построение физических карт; секвенирование, картирование экспрессии
Криминалистика: анализ образцов с места преступления; HLA-DQ
Онкология: рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, рак легких, рак щитовидной железы, меланома, гематологические злокачественные опухоли
Биология тканей и популяций: исследования генетической кластеризации; исследования по сохранению животных; экология; экологические науки; экспериментальная генетика.
Палеонтология: анализ археологических и музейных образцов
Зоология: диагностика зоонозных заболеваний и т.д.
Ботаника: выявление патогенов растений и т.д.