Изучить влияние гранул препарата «Гунцин» на клеточный апоптоз и сигнальную трансдукцию в тканях ворсин и линьков хориона человека на ранних сроках беременности и создать биологическую основу для клинической профилактики и лечения аномальных маточных кровотечений после медикаментозного аборта (кровотечений после медикаментозного аборта). Методы: 120 испытуемых были случайным образом разделены на 30 случаев в группе медикаментозного аборта Gongqing, группе медикаментозного аборта Xizhi, группе простого медикаментозного аборта и группе отсоса под отрицательным давлением; были собраны ткани ворсин хориона и линьки каждой группы для наблюдения ультраструктурных изменений клеток; скорость апоптоза (AR) определяли методом TUNEL, концентрацию внутриклеточных ионов кальция ([Ca2+]i)(Ca2+)(Ca2+)(Ca2+)(i)(Ca2+)(i)(Ca2+)(i)(ii)(iii)(Ca2+) определяли флуоресцентным спектрофотометром, экспрессию белка протеинкиназы C(PKC)（PKC）(PKC)(PKC) определяли методом иммуногистохимии. экспрессия белка. Результаты:В ультраструктуре ворсин хориона и метаморфозных клеток в группе аборта Мияги наблюдались типичные апоптотические изменения: повышение АР, [Ca2+] i и снижение экспрессии белка PKC, которые были статистически значимы по сравнению с тремя другими группами (P<0,05 или P<0,01). Вывод: гранулы Gongqing могут влиять на внутриклеточный Ca2+ и PKC-опосредованную трансдукцию клеточного сигнала, индуцировать апоптоз хориальных ворсин и линьки человека на ранних сроках беременности, способствовать полному отхождению хориальных ворсин и линьки, тем самым предотвращая и контролируя кровотечение после медикаментозного аборта. Преимуществами медикаментозного аборта являются безопасность и меньшая болезненность, однако существуют проблемы, такие как длительное кровотечение, обильное кровотечение и т.д. В некоторых случаях длительность кровотечения достигает 1-4 месяцев, неполный аборт составляет 6%-10%, существует потенциальный риск кровотечения. Формула китайского препарата Gongqing Granules - это эффективная формула, которая давно используется в клинической практике, одобрена Государственным управлением по контролю за лекарственными средствами для клинических исследований новых препаратов и успешно прошла II фазу клинического исследования. В данном исследовании мы изучили механизм действия гранул Gongqing для профилактики и контроля кровотечения после аборта с точки зрения апоптоза и сигнальной трансдукции, чтобы обеспечить биологическую основу для клинического применения и обогатить научный смысл теории "многих недостатков и застоя в послеродовом периоде" в китайской медицине. Данные и методы I. Испытуемые 120 пациенток, наблюдавшихся в гинекологической поликлинике филиала Шаньдунского университета традиционной китайской медицины с мая 2006 г. по октябрь 2007 г., были включены и исключены в соответствии с содержанием "Китайского акушерства и гинекологии", "Рутин диагностики и лечения в акушерстве и гинекологии" и "Руководства по клиническим исследованиям новых традиционных китайских лекарственных средств". В соответствии с таблицей случайных чисел испытуемые были разделены на группу аборта с применением препарата Gongqing (группа А), группу аборта с применением препарата Xi Zhi (группа В), группу простого медикаментозного аборта (группа С) и группу аборта с применением отсоса отрицательного давления (группа D) методом двойного слепого случайного распределения, каждая группа состояла из 30 случаев. Препараты и реагенты: мифепристон (China National Drug Administration (CNDA) H20000628, партия № 050501) и мизопростол (CNDA H10960144, партия № 050309) были произведены компанией Shanghai Hualian Pharmaceutical Co. Ltd. (разрешение на клинические исследования новых лекарственных средств 2003L01386). Группа А принимала мифепристон и мизопростол в соответствии с рутинной методикой медикаментозного аборта. Группа Б: Мифепристон и мизопростол принимали в 1-й день аборта по 48 г/сут в 3 приема в течение 3 дней. Группа В: Мифепристон и мизопростол принимали в 1-й день аборта по 15 капсул/сут в 3 приема в течение 3 дней. Группа С: Мифепристон и мизопростол принимали по обычной методике медикаментозного аборта, традиционные китайские препараты не принимали. 4. группа D: аборт с помощью отсоса под отрицательным давлением. Гистологический анализ 1. Забор материала: по 30 свежих ворсин хориона и 20 тканей мекония, выделенных после приема препаратов в группах А, В и С, и по 30 ворсин хориона и тканей мекония, полученных во время операции в группе D. Материалы немедленно промывали физиологическим раствором и фиксировали обычным способом. 2. Наблюдение ультраструктуры клеток с помощью просвечивающего электронного микроскопа Эпоксидная смола (812), ультратонкие срезы толщиной около 60 нм, двойное окрашивание диоксиранилацетатом и цитратом свинца, наблюдение на просвечивающем электронном микроскопе JEM-1200EX, фотографии. 3. Метод TUNEL для выявления клеточной АР После окрашивания образцов срезы окрашивали HE, депарафинировали, инкубировали с протеиназой K при комнатной температуре в течение 20 мин; капельно добавляли 50 мкл реакционной смеси TUNEL и инкубировали во влажном боксе при 37℃ в течение 60 мин; добавляли 50 мкл трансформирующего агента POD и инкубировали при 37℃ в течение 30 мин; срезы обезвоживали, осветляли и запечатывали DAB, гематоксилином окрашивали ядерную реакцию. Все срезы промывали PBS, а отрицательный контроль инкубировали с реакционным раствором TUNEL без терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы. Количественный анализ изображений: TUNEL-положительные реактивы локализовались в ядре и имели коричневато-желтый цвет, а цветоположительные клетки представляли собой апоптотические клетки [6]. Случайным образом выбирали десять непересекающихся полей зрения (×100) и оценивали процент положительных клеток. 4. Определение [Ca2+] с помощью флуоресцентного спектрофотометра i В флуоресцентном спектрофотометре Hitachi F-4500 решетка возбуждения была установлена на 5 нм, решетка эмиссии - на 10 нм, температура измерения - 37°C. Спектры возбуждения стандартного раствора Fura-2/AM и загрузочного раствора измерялись спектроскопически, длина волны их максимума уменьшилась с 380 нм до 340 нм, что свидетельствует о проникновении загрузки Fura-2/AM в клетки. Интенсивность флуоресценции (F-value) нагрузочного раствора Fu-ra-2 определяли во временном режиме (длина волны возбуждения 340 нм) при добавлении 10% TritonX-100 в конечной концентрации 0,1%, максимальную интенсивность флуоресценции Fmax определяли через 30 мин, а минимальную интенсивность флуоресценции Fmin - через 30 мин при добавлении ЭДТА в конечной концентрации 5 ммоль/,л. Интенсивность [Ca2+] i( нмоль/л)=Kd(F-Fmin/Fmas-F), Kd - константа диссоциации для реакции между Fura-2 и Ca2+, 224 нмоль/л при 37℃. 5. Иммуногистохимия для выявления изменений экспрессии клеточного белка PKC Образцы срезов депарафинировали, инкубировали с 3% H O при комнатной температуре в течение 10 мин, промывали и восстанавливали антигены в микроволновой печи; закрывали 10% нормальной козьей сывороткой и добавляли первичное антитело. После промывки срезы инкубировали с вторичными антителами, меченными ферментом хрена, в течение 30 мин при 37℃; после окрашивания хромогеном DAB срезы промывали водопроводной водой, повторно окрашивали и запечатывали. Результаты анализировались с помощью программы анализа изображений Leica QW in V3. Была выявлена отрицательная корреляция между интенсивностью экспрессии белка и размером серой шкалы, т.е. чем сильнее экспрессия белка, тем ниже серая шкала. V. Статистические методы Использовалось статистическое программное обеспечение SPSS12.0, результаты измерений выражались как среднее ± стандартное отклонение (± s), для сравнения различий между группами использовался сначала дисперсионный тест хи-квадрат, затем q-тест и тест ранговых сумм, а для счетных данных - тест x2. Результаты I. Общие положения После проведения статистического анализа различия между четырьмя группами по возрасту, фертильности, дням менопаузы и размерам гестационных мешков не были статистически значимыми и были сопоставимы. Ультраструктурное исследование ворсин хориона и метафазных клеток (рис. 1) Группа D. Поверхность трофобласта хориона и метафазных клеток была богата микроворсинками, базальная мембрана трофобласта была нормальной, ядра трофобласта и метафазных клеток были нормальными по морфологии, хроматин в ядре был равномерно распределен, органеллы были нормальными, в гранулозных клетках имелось большое количество секреторных гранул с высокой электронной плотностью, межклеточные связи были плотными. Группа С. Поверхностные микроворсинки трофобласта и метафазных клеток были отслоены, базальная мембрана трофобласта утолщена, ядра трофобласта и метафазных клеток неправильной формы, ядерная мембрана набухшая, наблюдались апоптотические морфологические изменения: скопление эухроматина, скопление гетерохроматина, конденсация ядер. В гранулозных клетках наблюдалось заметное уменьшение количества эндокринных гранул и расширение межклеточных перемычек. Группа В. Ультраструктурные изменения синцитиотрофобласта, цитотрофобласта, метафазных клеток и клеток гранулезы были аналогичны таковым в группе С. В группе В наблюдались апоптотические морфологические изменения. В группе А морфологические изменения апоптоза были более серьезными, чем в группах С и В. В синцитиотрофобласте, цитотрофобласте, метафазных и гранулозных клетках появились типичные апоптотические везикулы, содержащие органеллы с нормальной структурой. Изменения АР, [Ca2+] i и PKC в группе А. АР и [Ca2+] i хорионических трофобластов и метафазных клеток были повышены, серое значение PKC хорионических и метафазных клеток было увеличено, различия были статистически значимы по сравнению с тремя другими группами (P<0,05), что свидетельствует о снижении экспрессии белка PKC в группе А по сравнению с другими группами. Таблица 1 Изменения АР, [Ca2+]i и PKC в клетках хромаффинного трофобласта (±s) Группа Количество случаев АР (%) [Ca2+]i PKC серое значение Группа A 30 3,02±0,20*▲▲△ 125,37±6,40*▲△△ 135,71±3,82*▲△ Группа B 30 2,89±0,19* 120,33±7,58* 133,73± 3,81* Группа C 30 2 2,89±0,19* 120,33±7,58* 133,73± 3,81* Группа B 30 2,89±0,19* 120,33±7,58* 133,73± 3,81* Группа B 30 2,89±0,19* 120,33±7,58* 133,73± 3,82 3,81* Группа C 30 2,87±0,21* 119,91±6,80* 133,17±3,70* Группа D 30 2,17±0,23 109,03±7,84 127,51±3,73 *P<0,01 при сравнении с группой D ▲P<0,05 при сравнении с группой C ΔΔ при сравнении с группой B ΔΔΔ при сравнении с группой C ΔΔΔ при сравнении с группой B Группа В P<0,01 Таблица 2 Изменения АР, [Ca2+] i и PKC клеток ткани децидуа ( ±s) Группа Количество случаев АР (%) [Ca2+] i PKC Значение серой шкалы Группа А 20 3,13±0,18*▲△ 130,65±7,46*▲△ 142,80±4,93*▲△ Группа В 20 3,02±0,14* 125,14±8,04 * 139,17±4,94* Группа C 20 2,99±0,19* 124,42±7,96* 138,25±5,18* Группа D 30 2,83±0,15 110,31±7,53 131,45±4,03 *P<0,01 по сравнению с группой D ▲P<0,05 по сравнению с группой C △P<0,05 по сравнению с группой B ОБСУЖДЕНИЕ Последние исследования показали, что Аномальные маточные кровотечения после медикаментозного аборта связаны с недостаточным апоптозом клеток ворсин хориона и линьки, а клетки ворсин хориона и линьки после действия мифепристона проявляют тенденцию к апоптозу, и результаты настоящего исследования согласуются с этими данными. Доказано, что традиционная китайская медицина может регулировать апоптоз, активизация кровообращения и устранение застоя крови могут вызывать апоптоз и регулировать баланс между пролиферацией и апоптозом клеток, а очищающее тепло и тонизирующие средства могут вызывать апоптоз опухолевых клеток, но до сих пор не было ни одного исследования, посвященного традиционной китайской медицине, вызывающей апоптоз хорионических ворсин и экдиза человека на ранних сроках беременности для профилактики кровотечений после медикаментозного аборта. В настоящем исследовании мы наблюдали за ультраструктурными изменениями клеток ворсин и линьки в четырех группах женщин после аборта и обнаружили, что степень апоптоза клеток ворсин и линьки в гранулах Gongqing, используемых для медикаментозного аборта, была выше, чем в трех других группах, а AR ворсин и линьки в этой группе был значительно выше, чем в других группах, что позволяет предположить, что гранулы Gongqing обладают эффектом индуцирования апоптоза клеток ворсин и линьки при медикаментозном аборте у женщин на ранних сроках беременности. Для дальнейшего изучения механизма действия гранул Gongqing мы исследовали второй мессенджер Ca2+ и его важную молекулу-мишень - белок PKC, который является ключом к жизнедеятельности клеток. Са2+ является центром различных клеточных сигнальных путей, и есть данные, что повышенный уровень [Ca2+]i может вызывать апоптоз. В последние годы углубленно изучается апоптоз при лекарственно-индуцированных абортах, однако исследования перегрузки Ca2+ - важного фактора, участвующего в трансдукции апоптотического сигнала, - не представлены. Впервые мы включили [Ca2+]i в исследование влияния абортивных препаратов на апоптоз и обнаружили, что [Ca2+]i хорионических ворсин и мекония повышается под действием гранул Gongqing, что позволяет предположить, что гранулы Gongqing могут индуцировать апоптоз хорионических ворсин и мекония человека на ранних сроках беременности путем воздействия на Ca2+-опосредованную трансдукцию сигнала. В сигнальном пути PKC является важным белком-мишенью для действия внутриклеточного Ca2+ и играет важную роль в росте, дифференцировке и апоптозе клеток. Активация PKC опосредует различные биологические эффекты путем фосфорилирования сериновых/треониновых остатков молекул целевых белков, что может приводить к снижению уровня активации G-белков вследствие фосфорилирования, вызывать повышение уровня циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) и индуцировать апоптоз. Также сообщалось, что активация PKC вызывает повышение уровня внутриклеточного цАМФ, что способствует транскрипции, приводящей к пролиферации и дифференцировке клеток. Было установлено, что мифепристон ингибирует сигнальный трансдукционный путь PKC, а также водопадную киназную цепь raf-1 и активирующий деление белок в клетках трофобласта ранних сроков беременности, подавляет пролиферацию и деление, а также индуцирует апоптоз. В данном исследовании мы обнаружили, что экспрессия белка PKC в клетках хорионического трофобласта и клетках метафазной ткани была снижена после медикаментозного аборта, что позволяет предположить, что гранулы Gongqing могут подавлять дифференцировку и деление клеток и индуцировать апоптоз путем снижения экспрессии белка PKC. Китайская медицина считает, что медикаментозный аборт - это искусственное прерывание беременности, при медикаментозном аборте инь и кровь внезапно слабеют, газ не принимает кровь; или аборт не завершен, в матке остается застой крови, застой крови не проходит, новой крови трудно быть безопасной; или внешнее зло атаковано порождением жара, жаром повреждается кровь; или все три переплетаются друг с другом, сосуществуют реальное и виртуальное, что приводит к нечистым выделениям. "Застой крови, недостаток и жар - основные механизмы этого заболевания, активизация циркуляции крови для устранения застоя крови - ключ к лечению этого заболевания, циркуляция крови будет осуществляться при устранении застоя крови, а питание крови и благотворное влияние ци - основа лечения этого заболевания". Materia Medica, the principal medicine of Gongqing Granules, activates blood circulation and removes blood stasis, clears heat and stops bleeding; the ministerial medicines, Amaranthus, Radix et Rhizoma Gastrodiae, Radix Achyranthis Bidentatae, Radix Achyranthis Bidentatae, help the principal medicine to activate blood circulation and remove blood stasis, cools blood circulation and stops bleeding; the adjuvants, Radix Angelicae Sinensis, Radix Codonopsis Pilosulae, nourish blood and benefit the vitality of qi and activate blood circulation and remove blood stasis; and the medicine, Glycyrrhiza Glutinosa, tonifies and benefits qi and regulates the medicines; experiments have confirmed that this medicine can synergize with Mifepristone in anti-early pregnancy and increase the rate of complete miscarriage, shorten the time of vaginal bleeding, reduce vaginal bleeding, and does not influence the function of ovarian ovulation or the restoration of menses. Фармакодинамические эксперименты показали, что Gongqing Granules может значительно стимулировать гладкую мускулатуру матки, сокращать время свертывания крови, увеличивать содержание эстрогенов, оказывать антибактериальное и анальгетическое действие, а также установлено, что препарат имеет тенденцию вызывать апоптоз хорионических клеток. Установлено, что препарат способен вызывать апоптоз клеток ворсин хориона и ткани линьки на ранних сроках беременности, способствовать полному отхождению ворсин хориона и ткани линьки, тем самым предотвращая и контролируя кровотечение после медикаментозного аборта. Одним из механизмов его действия может быть регуляция Ca2+ и PKC-опосредованной клеточной сигнализации. Однако источник внутриклеточного Са2+ и точный механизм его действия на апоптоз ворсинок хориона и экхимозных тканей пока не выяснены, и углубленные исследования в этом направлении позволят глубже раскрыть патогенез этого заболевания, механизм медикаментозной профилактики и лечения.