1 Основы и концепции полимеразной цепной реакции
1.1 Основные принципы
Репликация ДНК в клетках представляет собой сложный процесс. Основными факторами, участвующими в репликации, являются: ДНК-полимераза, ДНК-лигаза, ДНК-шаблон, РНК-праймеры, синтезируемые инициирующими ферментами, нуклеотидные материалы, неорганические ионы, подходящий pH, а также несколько ферментов и белковых факторов, которые раскручивают суперспираль и двойную спираль ДНК.
Полимеразная цепная реакция — это реакция репликации ДНК в пробирке, основной принцип похож на реакцию in vivo, разница в том, что термостойкий фермент Taq вместо ДНК-полимеразы, с синтетическими праймерами ДНК вместо праймеров РНК, нагрев (денатурация), охлаждение (отжиг, изоляция (расширение) и другие методы изменения температуры ДНК может быть воспроизведена, повторная денатурация, отжиг, расширение цикла, вы можете сделать ДНК бесконечной амплификации. Конкретный процесс полимеразной цепной реакции заключается в следующем.
Система полимеразной цепной реакции нагревается примерно до 95°C, и двухцепочечный шаблон ДНК распутывается на две одиночные нити, этот процесс называется денатурацией. Затем температуру понижают ниже значения Km праймера, и 3′ и 5′ концы праймера связываются с комплементарными участками двух одноцепочечных ДНК-шаблонов, этот процесс называется отжигом. Когда температура реакционной системы повышается примерно до 70°C, термостойкая ДНК-полимераза Taq катализирует последовательное присоединение четырех дезоксирибонуклеотидов к 3′ концам праймеров комплементарно нуклеотидной последовательности шаблонной ДНК, образуя зарождающуюся нить ДНК. Каждый цикл примерно удваивает количество молекул ДНК в реакционной системе. Теоретически оно увеличивается до 2^n раз, если циклировать несколько раз. Когда после 30 циклов выход ДНК достигает 2^30 копий, что составляет около 10^9 копий. Процесс амплификации полимеразной цепной реакции показан на рисунке 8-1. Поскольку на практике эффективность амплификации не достигает 2-кратного значения, то, следовательно, она должна быть (1+R)^n, где R — эффективность амплификации.
1.2 Факторы, участвующие в системе реакции полимеразной цепной реакции, и их роль
Факторы, участвующие в реакции полимеразной цепной реакции, в основном включают нуклеиновую кислоту, праймеры, TaqDNA-полимеразу, буфер, Mg2+, дезоксинуклеотидтрифосфат (dNTP), температуру реакции и количество циклов, а также прибор для полимеразной цепной реакции. Их роли описаны следующим образом.
(I) Шаблонная нуклеиновая кислота
Шаблонная нуклеиновая кислота, используемая для полимеразной цепной реакции, может быть либо ДНК, либо РНК. Если в качестве шаблона используется РНК, сначала проводится обратная транскрипция для получения кДНК, а затем выполняется обычный цикл полимеразной цепной реакции. Шаблоны нуклеиновых кислот поступают из самых разных источников и могут быть выделены из культивируемых клеток, бактерий, вирусов, тканей, патологических образцов, археологических образцов и т.д.
Количество ДНК-шаблона, добавляемого в реакцию полимеразной цепной реакции, обычно составляет 100-100000 копий, и современный уровень техники позволяет приготовить соответствующую библиотеку кДНК из одной клетки. правильное количество ДНК-шаблона может уменьшить несоответствие оснований, вызванное несколькими циклами полимеразной цепной реакции.
Обычно для шаблона ДНК используется линейная молекула ДНК, в случае циклической плазмиды лучше сначала разрезать ее на линейную молекулу с помощью ферментов, так как циклическая ДНК соединяется слишком быстро.
(II) Праймеры
Праймеры определяют специфичность и длину продуктов амплификации полимеразной цепной реакции. Поэтому дизайн праймеров определяет успех или неудачу реакции полимеразной цепной реакции.
В полимеразной цепной реакции используются два типа праймеров, а именно: праймер для 5′ конца, представляющий собой олигонуклеотид с той же последовательностью, что и 5′ конец шаблона, и праймер для 3′ конца, представляющий собой олигонуклеотид, комплементарный 3′ концу шаблона. Основными требованиями к праймерам являются: ① Небольшая длина праймера повлияет на специфичность полимеразной цепной реакции, для обеспечения специфического связывания требуется 16-30bp, так как 4^16=4,29×10^9, что уже больше, чем 3×10^9bp генома млекопитающих; слишком длинные праймеры заставляют температуру удлинения превышать оптимальную температуру Taq ДНК-полимеразы (74 градуса), что также повлияет на специфичность продукта. Это также повлияет на специфичность продукта. ② Содержание G+C обычно составляет 40%-60%. ③ Четыре основания должны быть распределены случайным образом, и не должно присутствовать более трех последовательных одинаковых пуринов или пиримидинов. Особенно на 3′ конце праймера не должно быть 3 последовательных G или c, иначе это приведет к неправильной комплементации праймера к G или c обогащенной области нуклеиновой кислоты и повлияет на специфичность полимеразной цепной реакции. Сами праймеры не должны иметь комплементарных последовательностей, которые вызывают их собственное сворачивание, по крайней мере, сами праймеры не должны иметь более 3bp последовательных комплементарных оснований. ⑤ Два праймера не должны быть комплементарны друг другу, особенно их 3′ концы. Пара праймеров не должна иметь более четырех последовательных оснований, комплементарных друг другу, чтобы избежать образования димера праймера. ④ Гомология между праймерами и неспецифическими целевыми областями не должна превышать 70% или иметь 8 последовательных комплементарных оснований, гомологичных друг другу, иначе это приведет к неспецифической амплификации. ① 3′ конец праймера является точкой, где запускается удлинение. Поэтому он не должен быть несовпадающим. Поскольку ATCG вызывает несовпадение с определенным паттерном, наибольшее влияние оказывает A на 3′ конце праймера, поэтому старайтесь избегать, чтобы первым основанием на 3′ конце праймера было A. 3′ конец праймера также не должен быть третьим основанием кодирующего кодона, чтобы не влиять на специфичность амплификации из-за простоты 3-го положения кодона. 5′ конец праймера может быть модифицирован, включая добавление сайта ферментного расщепления, мечение биотином, флуоресцентными веществами, дигоксином и т.д., введение сайтов мутации, введение промоторных последовательностей, введение белок-связывающих последовательностей ДНК и т.д. Дизайн праймеров лучше всего осуществлять с помощью компьютерной программы.
Концентрация праймеров в реакционной системе обычно должна составлять от О,1 до 0,5 мкмоль. Слишком высокие концентрации приводят к образованию димеров праймеров или неспецифических продуктов.
Значение Tm праймера связано с температурой отжига и рассчитывается как Tm=4(G+C)+2(A+T). Значение Tm праймера предпочтительно находится в диапазоне 55-80°C, причем наилучшим является значение, близкое к 72°C.
(C) Термостойкая TaqDNA-полимераза
Чиен выделил термостабильную полимеразу в 1976 году, а Эрлих выделил и очистил термостабильную полимеразу Tq, пригодную для полимеразной цепной реакции, в 1986 году, что заложило основу для превращения полимеразной цепной реакции в практическую технологию, и в настоящее время она производится с помощью рекомбинантных генов. Taq ДНК-полимераза имеет молекулярную массу 94 кД, а соотношение ферментов при 75°C составляет 150 бс/молекулу. Слишком высокая или слишком низкая температура реакции не влияет на ее элонгацию, Taq-лей обладает высокой термической стабильностью. Эксперименты показали, что период полураспада составляет 40 мин, 30 мин и 5 мин при 92,5°C, 95°C и 97,5°C, соответственно.
Очищенная Taqase не обладает 3′-5′ экзонуклеазной активностью in vitro, поэтому не имеет функции корректирующего считывания и может вызывать несовпадения во время амплификации. На количество несовпадений оснований влияют температура, концентрация Mg2+ и количество циклов. Обычно частота несовпадений при 30 циклах Taqase составляет около 0,25%, что выше, чем частота несовпадений фермента Klenow. taqase производит частоту мутаций сдвига 1/30 000 и частоту замен оснований 1/8000 в каждом цикле. Применение низкой концентрации dNTP (20 мкмоль/л каждого), концентрации Mg2+ 1,5 ммоль/л и температуры выше 55°C для репликации может улучшить верность Taqase, когда средняя частота несоответствий составляет всего 5×10^-6 раз/(нуклеотид*цикл).
Taqase обладает TdT-подобной активностью, сходной с активностью концевой трансферазы, и может добавлять -основание к 3′ концу вновь образованного двухцепочечного продукта, особенно легко добавляется dATP. Поэтому, чтобы клонировать продукт полимеразной цепной реакции в вектор, можно использовать два способа: один — сконструировать dT-вектор; другой — использовать фермент Кленова для удаления A с 3′ конца, то есть после полимеразной цепной реакции сначала инактивировать Taqase путем нагревания при 99℃ в течение 10 мин, отрегулировать концентрацию Mg2+ до 5-10 ммоль/л, добавить 1-2U фрагмента Кленова и действовать в течение 15-20 мин при комнатной температуре. После 15-20 минут действия А на 3′ конце отрезается, и таказа также обладает активностью обратной транскрипции. Таказа также обладает активностью обратной транскрипции. Активность, сходная с активностью обратной транскриптазы, проявляется при 68°C при концентрации Mg2+ 2-3 ммоль/л. Активность обратной транскрипции лучше в присутствии Mg2+, и, используя эту активность, ее можно непосредственно использовать в РНК-полимеразной цепной реакции, особенно для амплификации коротких фрагментов.
В прошлом, полимеразная цепная реакция амплификации с ферментом Taq, как правило, могла амплифицировать только фрагменты ДНК менее 400bp, после модификации структуры и функции фермента, а также улучшения методологии полимеразной цепной реакции, теперь можно амплифицировать ДНК более чем в 20kb.
Количество фермента Taq, добавляемого в полимеразную цепную реакцию, также очень важно, слишком мало, конечно, не хорошо, слишком много, с одной стороны, расточительно, но также приводит к неспецифической амплификации, обычно 1-2,5U фермента Taq на lOOμl реакционного раствора является хорошим. Лучше всего определить оптимальную концентрацию фермента в диапазоне 0,5-5U. Другой вопрос заключается в том, что хотя Taqase является инструментальным ферментом с хорошей термостабильностью, следует соблюдать осторожность при хранении его при -20°C.
(iv) Буфер
Буферы обеспечивают соответствующий pH для реакций полимеразной цепной реакции с определенными ионами, обычно 10-50 ммоль/л. Буфер Tris-HCI (pH 8,3-8,8). Буфер, содержащий 50 ммоль/л KCl, облегчает отжиг праймеров. Некоторые люди и добавляют телячий сывороточный альбумин (100 мкг/л) или желатин (0,0%) или Twen20 (0,05%-0,1%) или дитиотрейтол (ДДТ, 5 ммоль/л) и т.д., которые, как считается, защищают фермент Taq.
(E) Mg2+Для активности Taqase необходим Mg2+. Слишком низкая концентрация Mg2+ значительно снижает активность Taqase; слишком высокая концентрация Mg2+ катализирует неспецифическую амплификацию. Концентрация Mg2+ также влияет на отжиг праймера, температуру расцепления шаблона и продуктов полимеразной цепной реакции, образование димера праймера и т.д. Активность таказы связана только с концентрацией свободного Mg2+, в то время как в системе полимеразной цепной реакции все фосфатные группы в dNTP, праймерах, шаблонах ДНК и т.д. могут связываться с Mg2+ и снижать концентрацию свободного Mg2+. Поэтому общее количество Mg2+ должно быть на 0,2-0,25 ммоль/л выше, чем концентрация dNTP. Если реакционная система содержит хелатирующие агенты, такие как ЭДТА, часть Mg2+ также может быть связана.
Для получения оптимальной концентрации Mg2+ можно использовать следующий метод оптимизации. Сначала в буфер для полимеразной цепной реакции не добавляют Mg2+, а в каждую реакционную пробирку добавляют определенное количество из настроенного 10 ммоль/л раствора для хранения Mg2+, начиная с градиента концентрации 0,5 ммоль/л (0,5,1,0,1,5,2,0,2,5,……5. 0 ммоль/л), приблизительный диапазон концентрации Mg2+ можно определить по результатам электрофореза после полимеразной цепной реакции, а затем точно определить оптимальную концентрацию Mg2+ путем увеличения и уменьшения нескольких концентраций выше и ниже этой концентрации на 0,2 ммоль/л.
(vi) dNTP
dNTP является исходным материалом для синтеза реакций полимеразной цепной реакции. Концентрация каждого dNTP должна быть одинаковой, и обычный диапазон концентраций составляет 20-200 гмоль/л. В пределах этого диапазона баланс между количеством продуктов полимеразной цепной реакции, специфичностью и верностью реакции является оптимальным. Например, при концентрации каждого dNTP 20 мкмоль/л теоретически можно получить 2,6 мкг ДНК длиной 400 п.н. Поддержание концентраций четырех dNTP выше их значений Km (10-15 мкмоль/л) поддерживает верность присоединения оснований; если концентрация dNTP превышает 50 ммоль/л, активность Taqase может быть подавлена.
(VII) Температура реакции и количество циклов
1. Температура и время денатурации
Этап денатурации в полимеразной цепной реакции очень важен. Если шаблонная ДНК и продукт полимеразной цепной реакции не могут быть полностью денатурированы, полимеразная цепная реакция не может быть успешной. Слишком высокая температура денатурации и время повлияют на активность Taqase, обычная температура денатурации и время 95 ℃, 30 с, иногда 97 ℃, 15 с. Хотя нить ДНК в температуре денатурации, когда две нити разделены только несколько секунд, но реакционная трубка внутри, чтобы достичь необходимой температуры по-прежнему необходимо определенное количество времени, группа продлить время соответствующим образом. Чтобы обеспечить тщательную денатурацию шаблонной ДНК. Предпочтительно 7-10 мин, затем установите шаг денатурации 95°C/мин в последующих циклах.
При амплификации коротких фрагментов длиной 100-300 п.н. также рекомендуется использовать быстрый двухэтапный метод полимеразной цепной реакции, т.е. денатурацию (94-97°C), отжиг и удлинение (55-75°C).
Для предотвращения испарения реакционного раствора при температуре денатурации в реакционную пробирку можно добавить 1-2 капли жидкого парафина.
2. Температура и время денатурации
Температура денатурации определяет специфичность полимеразной цепной реакции, и подходящая температура денатурации должна быть на 5°C ниже значения Tm праймера. Слишком низкая температура отжига приводит к неспецифической амплификации; повышение температуры отжига может улучшить специфичность амплификации, поэтому температура отжига должна быть строго задана. Время реакции отжига обычно составляет 1 мин.
В начале первого цикла полимеразной цепной реакции реакция начинается при температуре намного ниже значения Tm, а поскольку фермент Taq все еще активен при низких температурах, возможно появление неспецифических продуктов или димеров праймеров из-за неспецифических лигандных пар праймеров и шаблонов, а затем неспецифические продукты неоднократно амплифицируются в течение всей полимеразной цепной реакции, что приводит к серьезному сбою полимеразной цепной реакции. Чтобы попытаться устранить эту неспецифическую амплификацию, можно использовать горячий старт. Существует несколько методов горячего старта: один из них заключается в добавлении антитела против таказы в систему полимеразной цепной реакции. Антитело связывается с Taqase и вызывает ингибирование активности Taqase. Таким образом, в начале, хотя температура низкая и праймер может не совпадать с шаблоном, это не вызывает неспецифической амплификации, поскольку Taqase неактивна; когда проводится тепловая денатурация, антитело инактивируется при высокой температуре и Taqase высвобождается, она может функционировать для проведения специфической амплификации на последующих этапах удлинения
специфические реакции полимеризации ДНК на более поздних этапах удлинения. В другом методе горячего старта используется парафин для отделения Taqase от системы полимеразной цепной реакции, поэтому сначала также не происходит неспецифической амплификации при комнатной температуре. При нагревании до температуры тепловой денатурации парафин плавится, и Taqase смешивается с обратной системой полимеразной цепной реакции, таким образом, функционируя на последующих этапах. Использование горячего старта улучшает специфичность амплификации полимеразной цепной реакции.
3. Температура и время экстензии
Температура расширения обычно составляет около 72 ℃, в это время Taqase активность 35-100 нуклеотидов в секунду допинг, 2kb фрагмент с 1 мин было достаточно, если фрагмент ДНК длинный, время амплификации может быть увеличено соответствующим образом. Слишком длительное время амплификации может привести к неспецифической амплификации.
4. Количество циклов
Количество циклов зависит в основном от концентрации исходной целевой молекулы, например, при исходной целевой молекуле для 3×10^5, 1.5×10^4, 1×10^3 и 50 копийном числе, количество циклов может быть 25-30, 30-35, 35-40 от 40-45 соответственно. слишком большое количество циклов увеличит количество неспецифических продуктов и количество несоответствий оснований. Увеличение продуктов амплификации не становится экспоненциальным на поздних стадиях полимеразной цепной реакции, что называется эффектом плато. Эффект плато может быть связан со следующими факторами: более низкими концентрациями dNTP и праймеров, относительно меньшим соотношением фермента к планшету, снижением активности фермента после нескольких циклов и неполной денатурацией при более высоких концентрациях продукта, что влияет на удлинение праймера.
(H) Прибор для полимеразной цепной реакции
Существует множество импортных и отечественных приборов для полимеразной цепной реакции. Повышение и понижение температуры прибора может быть газовым нагревом, водяным нагревом и нагревом электрического нагревательного блока. Температура, количество циклов и временные параметры в настоящее время в основном контролируются компьютером. Прибор может быть выбран в зависимости от потребностей.
Поскольку метод полимеразной цепной реакции является высокочувствительным, небольшое количество целевых молекул может быть расширено до бесконечного числа. Поэтому важно предотвратить загрязнение окружающей среды продуктами амплификации полимеразной цепной реакции и последующие ложноположительные результаты полимеразной цепной реакции. По этой причине приборы для проведения полимеразной цепной реакции и процессы обнаружения продуктов полимеразной цепной реакции должны быть отделены от подготовки образцов и пробирок для полимеразной цепной реакции как можно большим пространством, предпочтительно в отдельных помещениях. Экспериментальное пространство обычно можно разделить на зону обработки образцов, зону подготовки реакционной смеси и амплификации полимеразной цепной реакции, зону анализа продуктов и т.д.
2 ПЦР-исследование
ПЦР — это метод быстрой амплификации специфических генов или последовательностей ДНК in vitro, поэтому он также известен как амплификация генов in vitro. Метод полимеразной цепной реакции похож на естественный процесс репликации ДНК, а его специфичность зависит от олигонуклеотидных праймеров, которые комплементарны обоим концам целевой последовательности.
2.1 Нормальные значения ПЦР
В организме присутствует нормальное разнообразие и соотношение флоры, организм находится в динамичном и сбалансированном состоянии здоровья.
2.2 Клиническое значение ПЦР
Полимеразная цепная реакция может быстро и специфически амплифицировать любой известный целевой ген или фрагмент ДНК и легко амплифицировать целевые гены в исходных смесях ДНК на уровне пикограмма (пг) до специфических фрагментов ДНК на уровне нанограмма, микрограмма и миллиграмма. В результате технология полимеразной цепной реакции с момента своего появления быстро и широко используется в различных областях молекулярной биологии.
Аномальные результаты: Аномалии, вызванные различными заболеваниями, например, сифилисом. (1) Сифилис I стадии. Инкубационный период составляет от 2 до 4 недель, с твердой темно-красной массой и неглубокими язвами в области наружных половых органов, с хрящеподобной твердостью и увеличенными окружающими лимфатическими узлами. (2) Вторая стадия сифилиса. В первой стадии сифилиса через 1 — 2 месяца на коже и слизистых оболочках тела появляются симметричные генерализованные высыпания, сыпь, папулы, пустулы и т.д.. На слизистых оболочках могут появляться слизистые пятна и плоские бородавки, которые очень заразны. (3) Сифилис III стадии. Он может также поражать кости, суставы, сердце и кровеносные сосуды, проявляясь в виде аортита, атрезии аортального клапана, аневризмы аорты и т.д. Он поражает нервы в виде спинальной чахотки и общего паралича (паралитическое слабоумие) и т.д.
Люди, нуждающиеся в скрининге: пациенты с подозрением на определенное заболевание для молекулярно-специфического скрининга.