I. Обзор метастазов в печень при колоректальном раке
Печень является наиболее распространенным и метастатическим органом для колоректальных опухолей. Сообщается, что в США ежегодно обнаруживается около 150 000 новых случаев колоректального рака, и 1/4-1/3 из них относятся к продвинутой стадии, т.е. IV стадии по TNM. В 1990 году, по данным Американского онкологического общества, от колоректального рака умерло 61 000 человек, из них почти 40 000 — от метастазов в печени.
На момент первичной консультации около 10% пациентов имели стадию А по Дьюку, 20%-30% — стадию В, 30%-40% — стадию С, остальные — метастатические пациенты. Наиболее преобладающим метастатическим органом является печень. Около 60% пациентов имеют метастазы на момент первой диагностики колоректального рака. В течение 5 лет после хирургической резекции первичного поражения метастазы в печени могут возникнуть у 50% пациентов. Сообщается, что метастазы в печени могут встречаться в 36%-81% случаев колоректального рака при вскрытии после смерти [3]. Такая высокая частота может быть важным фактором, влияющим на общий уровень лечения колоректальных опухолей.
Что касается естественной выживаемости при метастазах в печень при колоректальном раке без какого-либо лечения, то она, как правило, невелика: средняя выживаемость составляет 6-10 месяцев, медиана — 4,5 или 6,6 месяца, а в некоторых случаях сообщалось даже о шестимесячной выживаемости, равной 0 [1]. Приведенная выше ситуация полностью иллюстрирует, что метастазы в печень при колоректальном раке имеют плохой прогноз при отсутствии активного лечения и являются одной из основных причин смерти от колоректального рака.
К сожалению, только около 20% пациентов с метастазами в печени подходят для хирургического лечения на момент постановки диагноза из-за чрезмерного размера метастазов в печени, их тесной связи с крупными кровеносными сосудами и множественных метастазов в печени [4]. В соответствии с текущим положением дел, представляется сложным улучшить процент хирургической резекции только за счет совершенствования хирургических методов. Только благодаря раннему выявлению наличия метастазов в печени можно лечить их как можно раньше, тем самым увеличивая выживаемость и улучшая прогноз.
Механизмы формирования метастазов в печень при колоректальном раке
Образование метастазов в печени при колоректальном раке — сложный процесс, в котором играют роль многочисленные факторы взаимодействия опухолевых клеток с хозяином. Основные процессы его метастазирования включают.
1. Инвазия внеклеточного матрикса В месте первичного очага адгезия между раковыми клетками снижена, плотность заряда на поверхности раковых клеток увеличена, сила взаимного отталкивания увеличена, клетки легко перемещаются, а различные ферменты, выделяемые опухолевыми клетками (такие как сериновые протеазы и матриксные металлопротеиназы), переваривают внеклеточный матрикс и легко прилипают и соединяются с подкожной мембраной, в результате чего опухолевые клетки прорываются через барьер, образованный соединительной тканью.
2. Попадание в портальную систему Раковые клетки прилипают к подвальной мембране и эндотелиальным клеткам сосудов, нарушается цитоскелет эндотелия сосудов и увеличивается клеточный зазор. Под действием матриксной металлопротеиназы, гепариназы, цитокинина, эластазы и урокиназы раковые клетки пересекают сосудистый эндотелий и подвальную мембрану и попадают в портальную систему.
3.Раковые клетки выживают в циркуляции Большинство раковых клеток, попадающих в кровь, погибают в организме хозяина, некоторые находятся в спящем состоянии, а небольшая субпопуляция клеток с высоким метастатическим потенциалом может прилипать к эндотелию сосудов и проникать через стенку сосуда, образуя метастатические очаги.
4. Пролиферация раковых клеток в печени Могут ли раковые клетки расти в новой микросреде после проникновения в кровеносные сосуды — это ключ к окончательному формированию метастатических очагов. Раковые клетки могут образовывать метастазы в печени только тогда, когда они пролиферируют в микрососудах в подходящих условиях внутрипеченочной микросреды [7].
Образование метастазов в печени при колоректальном раке связано с биологическими характеристиками раковых клеток, иммунным статусом организма и микроокружением печени. Образование метастазов CRC в печени может быть просто выражено следующим образом: первичный колоректальный рак — кровь по воротной вене — печень — печеночная вена в легочную циркуляцию во все тело (или в желчь).
III. Молекулярные маркеры, связанные с метастазированием колоректального рака в печень
Инфильтрация и метастазирование происходят при участии некоторых белков, таких как стимуляция адгезии между опухолевыми клетками и клетками хозяина или внеклеточного матрикса; гидролиз белков опухолевых клеток к барьерам хозяина, таким как базальная мембрана, направленное движение опухолевых клеток и клональный рост в органе-мишени.
(I) Изменение рецепторов, связанных с клеточной адгезией
1. кальмодулин-лигандная белковая система: β-кадхерин (β-катенин) — это цитоскелетный белок, который связывается с С-концом кальмодулина (E-кадхерин), а N-концевой конец связывается с α-кадхерином (α-кат), образуя комплекс E-кад/β-кат/α-кат, который прикрепляется к актиновым филаментам с помощью α-кат [8] . E-кальмодулин Комплекс E-cad/β-cat/α-cat является основной молекулой адгезии, которая поддерживает полярность, морфологию и гистологическую целостность эпителиальных клеток. При потере функции комплекса межопухолевая адгезия клеток снижается, и они легко отделяются, вторгаясь в окружающие ткани. Показано, что делеция β-катенина связана с метастазированием в печень при колоректальном раке [9].
Карциноэмбриональный антиген (КЭА): CEA — это высокогликозилированный гликопротеин клеточной поверхности, член суперсемейства иммуноглобулинов, который является молекулой адгезии опухолевых клеток и играет важную роль в рецидивировании и метастазировании колоректального рака. Он наиболее широко используется для раннего выявления метастазов в печень при колоректальном раке [10]. Рецепторы CEA присутствуют на печеночных клетках Купфера и вызывают секрецию цитокинов (IL-1α, IL-1β, IL-6, TNFα) из клеток Купфера. Он вызывает экспрессию молекул межклеточной адгезии эндотелиальными клетками печеночных синусоидов, тем самым увеличивая адгезию и удержание опухоли в печени [11].
3. CD44: фактор адгезии CD44 на поверхности опухолевых клеток представляет собой трансмембранный гиалуронановый рецептор, который опосредует адгезию к эндотелиальным клеткам. Высокая экспрессия вариантов CD44v6 и CD44v8-10 тесно связана с метастазированием колоректального рака в печень [12,13]. Варианты сплайсинга CD44 могут влиять на миграцию и подвижность опухолевых клеток, способствуя адгезии опухолевых клеток к эндотелиальным клеткам сосудов и внеклеточному матриксу, способствуя инвазии опухолевых клеток в строму, влияя на агрегацию и распределение цитоскелетных белков опухоли. Сочетание нескольких аспектов, таким образом, влияет на формирование метастазирования опухоли [14]. Опухолевые клетки, экспрессирующие варианты CD44, могут избегать распознавания иммунной системой хозяина в процессе метастазирования и не подвергаться клиренсу.
Интегрины: Эти молекулы в основном опосредуют адгезию клеток к внеклеточному матриксу (ECM), позволяя интегрировать внутриклеточный каркас с внеклеточным матриксом в единое целое, а также участвуют в межклеточной адгезии. Takamura H et al. показали положительное окрашивание на интегрины αVLA3 в 58% (11/19) тканей колоректального рака с метастазами в печень с помощью иммуногистохимического анализа, что было значительно выше по сравнению с неметастатическими тканями (0%). Увеличение интеграна α3β1 предполагает, что он может играть важную роль в метастазировании печени при колоректальном раке.
5, Сиалилированный олигосахарид Льюиса-X (sLex) антиген: SLX также является лигандом для эндотелиальной лейкоцитарной молекулы адгезии-1 (ELAM-1), как рецептор для E-селектина на поверхности эндотелиальных клеток печеночных сосудов. лиганд ELAM-1, который играет важную роль в метастазировании печени колоректального рака. Опухолевые клетки с высокой экспрессией антигена sLex выходят из первичного очага, попадают в сосудистую сеть, прилипают к эндотелию печеночных сосудов, растут и образуют метастазы в печени, которые с большей вероятностью проникают через подвальную мембрану, прилипают к активированным эндотелиальным клеткам сосудов человека и образуют метастазы в печени. Исследования подтвердили, что экспрессия антигена sLex в метастатических очагах колоректального рака сильнее, чем экспрессия антигена sLex в первичных очагах [18,19].
Опухоль-ассоциированные антигены CA 19-9 и sLex экспрессируются во всей толстой кишке. Эти гликоантигены повышаются по мере развития рака толстой кишки от неметастатических до метастатических опухолей, а sLex является общей характеристикой клеток рака толстой кишки, склонных к метастазированию. Определенные антигены, связанные с сывороточными антигенами, также связаны с прогрессией опухоли; уровень антигена CA19-9 значительно выше при аденоме и раке толстой кишки, чем в нормальной слизистой. Другие лектины, такие как лактозосвязывающий лектин или галактозосвязывающий лектин-3 (галектин-3), также были связаны с опухолевой трансформацией и метастатическим развитием [20, 21].
(ii) Изменения протеаз
Опухолевые клетки отделяются от подвальной мембраны или внеклеточного матрикса, а клеточные протеазы разрушают подвальную мембрану или внеклеточный матрикс и проникают в лимфатические или кровеносные сосуды, образуя инфильтрат и метастазы. Протеазы, разрушающие внеклеточный матрикс (ECM), включают сериновые протеазы, металлопротеазы, эластазы и цистеиновые протеазы. Среди них семейство металлопротеиназ (ММП) считается наиболее важной группой протеаз и важной мишенью для борьбы с опухолевым метастазированием. Наиболее изученными при колоректальном раке являются матриксные металлопротеиназы, урокиназа и др.
1. Матриксные металлопротеазы (ММП) ММП — это металлозависимая эндопептидаза с протеазной активностью в отношении различных компонентов ЭЦМ. Она регулируется тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (TIMP) и матриксной металлопротеиназой мембранного типа (MT-MMP).
ММП можно разделить на следующие группы: коллагеназы (или желатиназы), стромелизин, матрилизин и МТ-ММТ. Наиболее важными коллагеназами являются ММП-2 и -9, которые гидролизуют коллаген из ЭКМ. ММП в нормальной ткани толстой кишки присутствует только в нейтрофилах в кровеносных сосудах и в макрофагах в собирательных лимфатических узлах. Количество ММП-2 и -9 выше в карциномах и коррелирует со стадией по Дьюксу.
2. Активатор плазминогена ДеБруин и др. показали, что активность активатора плазминогена урокиназного типа (uPA) была низкой в нормальной слизистой оболочке толстой кишки, тогда как активность активатора плазминогена тканевого типа (TTPA) была низкой. Активность активатора плазминогена типа (tPA) была высокой, но при раке толстой кишки наблюдалась обратная картина, а активность при аденоме толстой кишки была средней.
Уровень экспрессии uPA отрицательно коррелировал с прогнозом, и было показано, что уровень белка uPA значительно коррелирует с опухолевым ангиогенезом. Рецептор фибринолитического активатора урокиназного типа (рецептор uPA, uPAR) высоко экспрессируется в опухолях желудочно-кишечного тракта человека, включая рак желудка, поджелудочной железы и толстой кишки. Экспрессия uPAR все еще не до конца выяснена в связи с образованием опухолей толстой кишки. Уровень PAI-1 в опухолях с активатором фибринолитического фермента урокиназного типа (ингибитор uPA, PAI) отрицательно коррелирует с прогнозом.
3, Сериновая протеаза II типа ST14/SNC19 была выделена в 1993 году из библиотеки мейотической гибридизации колоректального рака со способностью разрушать внеклеточный матрикс, что было связано с метастазированием. Также было подтверждено, что субстратами его действия являются uPA и предшественники HGF/SF (BC-uPA и Pro-HGF/SF), которые связаны с опухолевой адгезией, миграцией, инфильтрацией и ростом сосудов. В исследованиях колоректального рака метастазирование в лимфатические узлы было высоким у тех, кто имел высокую экспрессию ST14/SNC19 в параканкрозной слизистой.
Применяя технологию Microarray, сравнивая ST14 до и после трансфекции клеток RKO, было обнаружено, что 26 генов, связанных с метастазированием, экспрессируются по-разному. Среди них 15 генов способствовали метастазированию, а 11 — тормозили метастазирование опухолевых клеток. Экспрессия генов, способствующих метастазированию, была повышена, например, факторов роста, факторов клеточной адгезии, классов протеаз, связанных с метастазированием, молекул сигнальной трансдукции и онкогенов.
Экспрессия генов, препятствующих метастазированию, была снижена, например, Maspin и TIMP2. Изменения во всех этих генах могут привести к усилению метастазирования клеток. Однако пять из генов, экспрессия которых была снижена, были про-метастатическими генами, а семь из генов, экспрессия которых была повышена, были генами-супрессорами метастазирования, поэтому возможно, что метастатическая способность была снижена. Их влияние на метастазирование должно быть подтверждено дальнейшими исследованиями. Высокая экспрессия ST14 увеличивала способность клеток к миграции, способность к инвазии, способствовала деградации ECM и деполяризировала скелетный белок F-актин с помощью конфокальной микроскопии. Этот тип изменений был также подтвержден с помощью анализа микрочипов генов.
Генами, экспрессия которых значительно повышалась после трансфекции SNC19, были: BRMS1, CSAP8, caveolin-1, CSF1, C-ETS2, ETV4, HPSE, IGF2, KISS1, MGAT5,, CSAP9, H-Ras, ICAM5, KAI1, MMP15, MMP16, MUC1, PIK3. PAI2, TGFA.
Гены, экспрессия которых была значительно снижена после трансфекции SNC19, — MMP3, MMP7, Maspin, BCSG1, Osteopontin и TIMP-2.
4. Maspin, член суперсемейства ингибиторов сериновых протеаз, был получен методом мейотической гибридизации и дифференциального отображения глубоких Ls между нормальным эпителием молочной железы и раком молочной железы Zou et al. в 1994 году. Применяя метод дифференциального анализа мРНК, Институт онкологии Чжэцзянского университета обнаружил, что экспрессия маспина повышена в парных образцах рака желудка, поджелудочной железы и колоректального рака. При применении исследования генного микрочипа было также обнаружено, что экспрессия маспина значительно повышена в 16 случаях колоректального рака путем анализа 21 пары парных образцов колоректального рака и нормальных слизистых тканей. Трансфекция антисмыслового маспина клеточной линии колоректального рака COLO205 показала морфологические изменения в виде повышенной агрегации, усиленной адгезии и неправильной морфологии клеток колоректального рака. Исследование показало, что ген Maspin связан с метастазированием колоректального рака, но конкретный механизм его действия еще требует дальнейшего изучения для выяснения.
5.Измененная экспрессия других протеаз и ингибиторов протеаз Экспрессия гистоновой протеазы D (катепсин D) влияет на инфильтрацию раковых клеток. Секретируемые гистоновые протеазы в основном образуются из стромальных клеток, таких как фибробласты. При колоректальном раке гистон D также экспрессируется в злокачественных клетках, но связь с прогнозом неясна из-за большой вариабельности его экспрессии.
(iii) Сосудистый фактор роста
Здесь наблюдается синергетический эффект. Эти факторы также могут стимулировать рост опухолевых клеток посредством аутокринной стимуляции и паракринной секреции. Продукция различных сосудистых факторов роста, очевидно, важна для быстрого распространения и инфильтративного роста опухолей, поскольку обильное кровоснабжение необходимо для роста опухоли. b) Они стимулируют пролиферацию сосудистых эндотелиальных клеток и продукцию других капиллярообразующих факторов. b-FGF и TGF-b, a (TGF-b и a клетки колоректального рака могут продуцировать ангиогенин [25]/) основной фактор роста фибробластов (b-FGF) [25], трансформирующий фактор роста
Около 100 лет назад было обнаружено, что кровоснабжение в опухолях гораздо богаче, чем в окружающих нормальных тканях, независимо от того, индуцировано оно опухолевыми клетками или нет. В 1971 году Фолкман предложил, что рост опухоли зависит от кровоснабжения и что без притока крови, кислорода и питательных веществ опухоли становятся покоящимися, остаются размером 2-3 мм3 , а затем апоптотическими [26]. Существует ряд членов семейства сосудистых факторов роста, а на поверхности опухолевых клеток присутствует рецептор, связанный с сосудистым фактором роста (VEGFR). Связывание этого трансмембранного рецептора с лигандом VEGF активирует тирозинкиназу (TK), что в свою очередь приводит к пролиферации эндотелия сосудов и/или эндотелия лимфатических сосудов.
Среди членов семейства VEGF, VEGF A является основным медиатором сосудистой пролиферации, он связан с VEGF B, C, D и E, и каждый из них имеет связанные с ним VEGFR1, 2 и 3 и плацентарный фактор роста (PIGF). лимфатических сосудистых эндотелиальных клеток.
Помимо стимулирования пролиферации эндотелиальных клеток, VEGF может регулировать блуждание эндотелиальных клеток, увеличивать проницаемость сосудов и модулировать иммунные реакции для регулирования пролиферации лимфатических сосудов. По-видимому, сосудистые эндотелиальные клетки участвуют в развитии, инфильтрации и метастазировании опухолей.
(IV) Другие молекулы, связанные с метастазированием
Ген nm23 был выделен Стигом из линии клеток мышиной меланомы с различным метастатическим потенциалом. nm23 может регулировать пролиферацию клеток через процесс фосфорилирования серина. Среди них изоформа nm23-H1 более тесно связана с метастазированием опухоли [27]. Гомологичный ген человека nm23-HI также локализован на хромосоме 17q21, и эта полоса часто гетерозиготно теряется при колоректальном раке. При колоректальном раке человека было замечено, что LOH гена nm23-H1 может быть поздним событием в злокачественной прогрессии колоректального рака и тесно связана с тяжелым агрессивным поведением колоректального рака, что позволяет предположить, что ген nm23-H1 может быть вовлечен в регуляцию злокачественной прогрессии и метастатического процесса колоректального рака человека [28]. Однако по мере развития исследований были сделаны противоположные выводы [29].
2, ген PRL3 Vogelstein и коллеги использовали серийный анализ экспрессии генов (SAGE.) для выявления фосфатазы регенерирующих метастазов печени, которая высоко экспрессировалась во всех 12 раках толстой кишки, PRL-3 (фосфатаза регенерирующей печени-3, также известная как PTP4A3Protein tyrosine phosphatase type IVA3), которая не экспрессировалась в соответствующей первичной опухоли того же человека. Она относится к новому классу изопренилированных фосфатаз [30].
3. белок костного моста (OPN) OPN — секретируемый гликозилированный фосфопротеин, который не только тесно связан с минерализацией костной ткани, но и с различными физиологическими и патологическими явлениями, такими как Ca2+, NO и другие клеточные мессенджеры, хемотаксический ответ макрофагов, пролиферация гладкомышечных клеток, метастазирование и инфекция опухолей, и рассматривается как новая клеточная сигнальная молекула [31]. Показано, что экспрессия OPN значительно выше в метастатических тканях печени при колоректальном раке по сравнению с первичной опухолью [32], а его лиганд-рецепторное взаимодействие может играть важную роль в развитии метастазирования печени при колоректальном раке. Ding Ling et al. продемонстрировали, что опухолевые клетки, экспрессирующие остеопонтин, имели сниженную гомогенную адгезию и легко отделялись от исходных опухолевых масс. Напротив, способность к гетерогенной адгезии была повышена, например, повышалась адгезия между эндотелиальными клетками сосудов, которые легко прикреплялись к метастатическому участку. По данным иммуногистохимического наблюдения, ткань опухоли и окружающие ее ткани печени были положительно окрашены, что может быть связано с наличием рецептора CD44 и интегринов в гепатоцитах.
Белок Ras в основном участвует в клеточной пролиферации и трансдукции сигналов; белок Rab участвует в регуляции внутриклеточного мембранного трафика; белок Rho (30% гомологии с Ras) играет регуляторную роль в составе цитоскелетной сети. Белок Rho (30% гомологии с Ras) играет регуляторную роль в составе цитоскелетной сети, тем самым влияя на морфологию клетки [33]. Было показано, что сверхэкспрессия белка Rho была обнаружена в метастазах печени при колоректальном раке [34]. Было установлено, что дефекты в кодоне 12 Ki-ras и метастатический потенциал печени при колоректальном раке тесно связаны [35].
Хотя благодаря настойчивым усилиям исследователей выявляется все больше генов, связанных с метастазированием колоректального рака в печень и сопутствующими молекулярными событиями. Фогельштейн и др. предположили, что сотни ассоциированных с опухолью генов связаны друг с другом в небольшие «узлы» и их сети, а узлы связаны друг с другом как группа сетей [45]. Возникновение метастазов в печени должно включать синергическое или антагонистическое действие нескольких генов и белков, и противоречивые результаты некоторых исследований внесли путаницу в исследовательскую работу.
V. Молекулярная биология и биоинформатика метастазирования в печень при колоректальном раке
Все больше ученых применяют точку зрения системной биологии для изучения геномного уровня, уровня транскрипции и уровня экспрессии белков как единой системы, чтобы понять всю систему жизни на более широком и глубоком уровне. При метастазировании колоректального рака в печень Институт онкологии Чжэцзянского университета интегрировал данные об изменении числа копий хромосом для анализа различий профилей экспрессии генов среди разных фенотипов, а также изучил экспрессию генов, содержащихся в определенном сегменте хромосом. Были проведены следующие исследования.
(1) Семь хромосомных регионов амплификации и шесть хромосомных регионов делеции были выявлены при CGH-анализе 50 первичных колоректальных раков человека, среди которых высокочастотная делеция на 16q не была представлена подобным образом. Регион 16q20-21 был проанализирован с помощью биоинформатики для поиска генов, связанных с метастазами в печень, и далее проверен биотехнологическими методами один за другим для получения относительно целостной информации.
(2) Микрочип HG-U95A от AFFYMETRIX был применен для анализа профилей экспрессии всего генома 13 случаев тканей колоректального рака и 12 случаев метастазов в печень от рака толстой кишки, а 9 случаев соответствующих нормальных тканей слизистой оболочки толстой кишки были использованы в качестве контроля. При использовании одного и того же статистического алгоритма скрининга и одного и того же метода классификации, интеграция данных об изменении числа копий хромосом с данными генных микрочипов позволила существенно повысить точность классификации опухолей с 36% до 95% и получить набор генов, ассоциированных с метастазами в печень при колоректальном раке.