Апоптоз, также известный как запрограммированная клеточная смерть I типа, является фундаментальным биологическим процессом в организме, который не сопровождается воспалением или повреждением окружающих тканей; апоптоз участвует в эмбриональном развитии, гормональной регуляции, воспалении и опухолевом генезе. Аномальная регуляция апоптоза может нарушить баланс между пролиферацией и гибелью клеток; снижение апоптоза может привести к развитию злокачественных опухолей или аутоиммунных заболеваний; наоборот, повышение апоптоза приводит к нейродегенеративным патологиям или иммуносупрессии. Поэтому поддержание баланса апоптотической системы имеет большое значение в физиологических процессах организма.
Различные физиологические и патофизиологические факторы могут способствовать развитию апоптоза, который представляет собой энергозависимый процесс, использующий активацию ряда цистеиновых протеаз каспаз, ведущих к апоптотическому сигнальному пути. В зависимости от внешних стимулов апоптотическая сигнализация подразделяется на эндогенный путь или митохондриальный путь, в котором участвуют члены семейства белков Bcl-2 и митохондриальные белки, и экстринный путь, который опосредуется внеклеточными стимулирующими сигналами через рецепторы смерти (DR). Аутофагия, также известная как программируемая клеточная смерть II типа, является высоко консервативным механизмом клеточной смерти, который приводит к выживанию и гибели клеток, когда клетки сокращают поврежденные органеллы или внутриклеточные компоненты посредством аутофагии в состоянии голода, сложного механизма. Апоптоз и аутофагия не являются взаимоисключающими, и эти два регулятора клеточных сигнальных путей координируют друг с другом.
Стимуляция иммунной системы организма внешними антигенами вызывает пролиферацию антиген-специфических лимфоцитов для очистки от патогенов, а апоптоз играет важную роль в завершении приобретенного иммунного процесса, который включает в себя: Naïve Т-клетки пролиферируют и дифференцируются в эффекторные Т-клетки в ответ на стимуляцию антигеном; большинство дифференцированных эффекторных клеток переходят в истощенное состояние, чтобы предотвратить развитие аутоиммунного заболевания; несколько Т-клеток действуют как клетки памяти, выживая для функционирования. Апоптотический процесс уменьшает количество активированных Т-клеток и завершает иммунный ответ, превращаясь в активационно-индуцированную клеточную смерть (АИКД).
Различные патогены по-разному влияют на сигнальный путь клеточной смерти. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) может индуцировать апоптоз в иммунных клетках, особенно в CD4+ Т-клетках, и в данной статье рассматриваются механизмы, участвующие в апоптозе под действием ВИЧ.
1. Структура ВИЧ-1.
ВИЧ-1 является ретровирусом и членом семейства лентивирусов. Лентивирусная инфекция обычно проявляется в виде хронического процесса заболевания, длительной клинической латентности, устойчивой вирусологической репликации и поражения центральной нервной системы. Вирус иммунодефицита обезьян (SIV) и вирус иммунодефицита кошек (FIV) являются типичными примерами лентивирусных инфекций. ВИЧ-1 и ВИЧ-2 чрезвычайно похожи при электронной микроскопии, но молекулярный вес их белков и вспомогательные гены совершенно разные. ВИЧ-2 генетически ближе к SIV, обнаруженному у белых обезьян, чем ВИЧ-1, и поэтому можно предположить, что ВИЧ мог передаваться от обезьян к человеку. И ВИЧ-1, и ВИЧ-2 могут реплицироваться в клетках CD4 и являются патогенами, вызывающими заболевания у инфицированных людей.
Вирусные частицы ВИЧ-1 имеют диаметр 100 нм и окружены липопротеиновой мембраной. Каждая вирусная частица содержит 72 гликопротеиновых комплекса, которые интегрированы в липидную мембрану. Каждый гликопротеиновый комплекс состоит из тримера экстернального гликопротеина gp120 и трансмембранного белка gp41. gp120 и gp41 слабо связаны и могут спонтанно выходить в местную среду, а гликопротеин gp120 обнаруживается в сыворотке и лимфоидной ткани ВИЧ-инфицированных пациентов. Во время вирусного роста он также связывает различные белки хозяина, такие как HLA-I или II, на мембране клетки-хозяина с собственным липопротеиновым слоем, или связывает белок адгезии ICAM-I, чтобы вызвать адсорбцию вируса на других клетках-мишенях. Матриксный белок p17 распределен на внутренней стороне вирусной липопротеиновой мембраны, а вирусный белок p24 содержит две копии ВИЧ-РНК; вирусные частицы ВИЧ-1 также включают ферменты, необходимые для вирусной репликации, такие как обратная транскриптаза RT, интеграза p32 и протеаза p11.
Типичная структура ретровирусного генома содержит в основном 5- и 3-длинные терминальные повторы (LTR), гены gag, pol и env. Длинные терминальные повторы — это два конца вирусного генома, которые не кодируют вирусные белки и соединяются с ДНК клетки-хозяина при интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина. Гены env и gag кодируют вирусные цитозольные гликопротеины и нуклеокапсиды; ген pol кодирует обратную транскриптазу и другие ферменты. Кроме того, в геном ВИЧ включены шесть генов: vif, vpu, vpr, tat, rev и nef.
Белки Tat и rev — это регуляторные белки, которые связываются со специфическими областями вирусной РНК в ядре, и оба являются элементами трансактивационного ответа для LTR и для вирусного цитозольного гликопротеинового гена env, соответственно. Белок tat — это элемент трансактивации, необходимый для вирусной репликации в культуральных системах in vitro и являющийся потенциальным транскрипционным фактором для промоторной области LTR. Регуляторный белок клеточного цикла T1 является клеточным кофактором, необходимым для Tat. Белки tat и rev стимулируют транскрипцию провирусной ДНК ВИЧ-1 в РНК, инициируют элонгацию РНК и способствуют транслокации РНК ВИЧ из ядра в цитоплазму.
Белки Vpr необходимы для репликации вируса ВИЧ в неделящихся клетках; современные исследования показывают, что белки Vpr блокируют остановку клеточного цикла в фазе G2; они также транслоцируют вирусные преинтеграционные комплексы в ядро.
Белки Nef имеют множество функций в клетке. Исследования показали, что белки Nef вызывают даунрегуляцию экспрессии молекул CD4 и HLA-I на поверхности инфицированных ВИЧ-1 клеток. Белки Nef связываются со многими белками сигнальных путей и препятствуют активации Т-лимфоцитов. Дополнительные исследования показали, что делеция гена Nef задерживает вирусную репликацию, но не предотвращает развитие СПИДа.
Белок Vpu участвует в размножении вирусов ВИЧ. Мутации гена vpu приводят к тому, что вирусные частицы ВИЧ остаются на поверхности клетки хозяина. vpu участвует в деградации комплекса CD4-gp120 в эндоплазматическом ретикулуме, позволяя gp160 войти в рециркуляцию и сформировать новые вирионы ВИЧ.
Белок Vif играет важную роль в репликации ВИЧ. vif-дефицитные вирусы ВИЧ не могут реплицироваться в CD4+ Т-клетках и макрофагах, то есть они не могут реплицироваться в этих «непермиссивных» клетках, в то время как дикие штаммы, содержащие гены vif, могут реплицироваться в этих клетках. Исследования показали, что репликация ВИЧ зависит от наличия или отсутствия клеточного репрессора, эндогенного APOBEC3G, который является внутриклеточным ферментом редактирования РНК, деаминирующим цитозин в мРНК с образованием урацила, что приводит к накоплению G и A мутантов и, следовательно, к деградации вирусной ДНК. vif блокирует ингибирующую активность APOBEC3G путем связывания с APOBEC3G с образованием комплекса. В отсутствие vif, APOBEC3G интегрируется в новообразованные вирусные частицы и впоследствии блокирует образование провирусной ДНК в инфицированных клетках-мишенях; в присутствии белка vif, APOBEC3G связывается с белком vif, разрушается системой убиквитинирования и не интегрируется в новообразованные вирусные частицы. Вышеизложенные результаты позволяют предположить, что APOBEC3G является клеточным механизмом самозащиты, но vif — белок, которым вирус ВИЧ противодействует функции APOBEC3G, в результате чего вирус ВИЧ уклоняется от процесса внутриклеточного самоочищения.
2. Вирус ВИЧ и апоптоз иммунных клеток.
Вирус ВИЧ инфицирует иммунные клетки, что приводит к постепенному снижению количества CD4+ Т-клеток, постепенному снижению иммунной функции организма и различным оппортунистическим инфекциям. Белок оболочки ВИЧ Env и поверхностные молекулы CD4 иммунных клеток связываются, что приводит к репликации вируса ВИЧ в CD4-клетках и, в конечном итоге, к гибели клеток. Зрелые CD4+ Th-клетки являются ключевыми эффекторными клетками в противовирусном иммунном ответе, и ранее считалось, что ВИЧ-ассоциированный иммунодефицит является результатом опосредованного вирусом уничтожения CD4+ T-клеток, однако эта точка зрения считается слишком упрощенной в свете современного понимания механизма снижения количества CD4+ T-клеток. Было предложено несколько гипотез снижения количества CD4+ Т-клеток под воздействием ВИЧ: они включают производство поврежденных Т-клеток в тимусе и хоминг вирус-специфических Т-лимфоцитов в лимфоидной ткани, что изменяет пролиферативный баланс CD4+ Т-клеток и приводит к ВИЧ-индуцированному апоптозу. Появляется все больше доказательств того, что ВИЧ-индуцированный апоптоз лимфоцитов является важной причиной разрушения иммунной системы вследствие ВИЧ-инфекции. Из-за непрерывной репликации вирусных частиц ВИЧ ВИЧ-инфекция приводит к ускоренной скорости обновления Т-клеток in vivo, что приводит к ускоренному размножению Т-клеток, а последнее контролирует количество Т-клеток путем увеличения апоптоза в нормальных физиологических условиях. Кроме того, ВИЧ приводит к иммунному уклонению путем запуска апоптотических механизмов в клетках; молекулярные механизмы иммунного уклонения ВИЧ включают быструю вирусную мутацию и даун-регуляцию экспрессии молекул MHC клетки-хозяина.
Молекулярные механизмы ВИЧ-ассоциированного апоптоза лимфоцитов включают: прямое убийство инфицированных клеток-мишеней вирусом ВИЧ; гибель сторонних клеток под воздействием проапоптотических вирусных белков, высвобождаемых из инфицированных клеток; убийство ВИЧ-специфических эффекторных клеток после их привлечения в инфицированные лимфоидные ткани; изменение внутриклеточных регуляторных молекул апоптоза.
Апоптоз является важной формой клеточной смерти, которая регулируется апоптотическим клеточным сигнальным путем, что является важным способом поддержания гомеостаза лимфоцитов in vivo. Кроме того, в иммунном ответе против чужеродных антигенов апоптоз требует сокращения большинства антиген-специфических Т-клеток для блокирования аутоиммунного ответа. Апоптоз осуществляется через два основных пути трансдукции: Гибель клеток, вызванная активацией (AICD), которая в основном опосредуется рецепторами смерти (экзогенный сигнальный путь), и автономная гибель активированных Т-клеток (ACAD). Последняя опосредуется белками, связанными с BCL-2 (эндогенный сигнальный путь). Экзогенный апоптотический сигнальный путь запускается связыванием рецепторов смерти семейства фактора некроза опухоли и их лигандов; эндогенный апоптотический сигнальный путь запускается внутриклеточными рецепторами, проводящими сигналы к митохондриям.
После острой ВИЧ-инфекции поражение CD4+ Т-клеток приводит к «вздутию», образованию синцития и апоптозу инфицированных клеток и окружающих их побочных клеток. gp120-gp41, геномный цитозольный гликопротеиновый комплекс ВИЧ, является основной молекулой, индуцирующей апоптоз, вызывая апоптоз инфицированных клеток и побочных клеток. апоптоз побочных клеток. Молекулы Env, экспрессированные в цитозоле инфицированных клеток, способны связываться с молекулами CD4 и кофакторами, что приводит к слиянию клеток, а образовавшийся синцитий приводит к апоптозу. ВИЧ или SIV вызывают синцитий, и снижение количества клеток CD4 приводит к развитию СПИДа. В лимфатических узлах ВИЧ-положительных людей синцитий экспрессирует маркеры раннего апоптоза, и апоптоз синцития не опосредован Fas и рецептором фактора некроза опухоли 1, но ВИЧ-инфицированные Т-клетки более чувствительны к Fas-опосредованному апоптозу, и эта чувствительность может быть индуцирована продуктами ВИЧ, такими как vpu. Инфицированные клетки, экспрессирующие Env, и клетки, экспрессирующие комплекс CD4-CXCR4, сливаются, образуя синцитий, который индуцирует апоптоз через митохондрий-зависимый путь проведения, который опосредован апрегуляцией сигнального пути Cyclin B-CDK1 и ядерной локализацией mammalian target of rapamycin (mTOR). Это приводит к mTOR-опосредованному фосфорилированию серина 15 белка p53 (p53ser15), повышению экспрессии P53-зависимого белка BAX и активации митохондриального пути трансдукции, т.е. белок BAX встраивается в митохондриальную мембрану, высвобождая цитохром C и активируя каспазный путь трансдукции и апоптоз. Некоторые исследования показали повышенную экспрессию молекул циклина B и mTOR в периферической крови и клетках лимфатических узлов ВИЧ-инфицированных пациентов, причем последняя коррелирует с фосфорилированием серина 15 белка p53 (p53ser15) и вирусной нагрузкой. Более того, когда CD4+ Т-клетки периферической крови были сильно инфицированы вирусом ВИЧ in vitro, гибель клеток и некроз ассоциировались, но не с апоптозом.
Помимо вирусного белка Env ВИЧ, несколько других вирусных белков могут запускать апоптотические сигнальные пути как в инфицированных, так и в неинфицированных клетках. Эндогенный путь проводимости активируется вирусным белком vpr, что приводит к быстрому снижению мембранного потенциала митохондрий, высвобождению цитохрома с и апоптозу. Белок tat индуцирует апоптоз путем снижения уровня BCL-2 и повышения уровня каспазы-8. Кроме того, связывание молекул ВИЧ gp120 и CD4 индуцирует снижение BCL-2 и способствует высвобождению цитохрома c, тем самым вызывая апоптоз. Кроме того, активация каспазы-8 протеазой, кодируемой геномом ВИЧ, приводит к деградации белка BCL-2, что приводит к снижению уровня BCL-2 и тем самым индуцирует апоптоз. Современные исследования показывают, что вирус ВИЧ также влияет на апоптотические экзогенные пути проведения как в инфицированных, так и в сторонних клетках, при этом вирус ВИЧ gp120 и CD4+ Т-клетки перекрестно связываются и активируют Fas-FasL путь проведения; Nef-экспрессирующие Т-клетки коэкспрессируют FasL и становятся потенциальными убийцами ВИЧ-неинфицированных лимфоцитов, экспрессирующих молекулы Fas. Аналогичным образом, белки tat, секретируемые инфицированными клетками, повышают уровень молекул Fas и FasL в неинфицированных клетках, повышая их восприимчивость к Fas-индуцированному апоптозу. В заключение следует отметить, что вирус ВИЧ может контролировать апоптотические механизмы, что приводит к нарушению иммунной системы организма и благоприятствует иммунологическому уклонению от вируса.
Исследования показали, что ВИЧ-инфекция может приводить к автономной гибели активированных Т-клеток (ACAD). Т-клетки периферической крови пациентов с ВИЧ демонстрируют спонтанный апоптоз при культивировании in vitro без экзогенной стимуляции, что связано с даунрегуляцией экспрессии BCL-2. Клетки, экспрессирующие низкие уровни BCL-2, имеют активированный фенотип in vivo, что позволяет предположить, что повторная стимуляция Т-клеток in vivo вирусными антигенами приводит к иммунной активации, изменяя физиологический баланс активированных Т-клеток in vivo и приводя к активации членов семейства проапоптотических белков BCL-2 (pro-apoptotic BCL-2). Исследования in vivo на гориллах показывают отсутствие иммунной активации при непатогенной ВИЧ-инфекции, низкий уровень спонтанного апоптоза Т-клеток и нормальную внутриклеточную экспрессию белка BCL-2. acad обычно блокируется цитокинами, а IL-2 и IL-15 поддерживают выживание Т-клеток in vitro, способствуя повышению экспрессии BCL-2.
Т-лимфоциты ВИЧ-инфицированных пациентов могут подвергаться активационно-индуцированной клеточной смерти (AICD) in vitro после стимуляции митогеном, суперантигеном и TCR-специфическими антителами. Апоптоз, индуцированный сигнальным путем Fas, вовлечен в процесс AICD, а поверхности CD4+ T и CD8+ T клеток у ВИЧ-инфицированных пациентов Повышенная экспрессия Fas у ВИЧ-инфицированных пациентов увеличивает восприимчивость к Fas-опосредованному апоптозу, что коррелирует с прогрессированием заболевания при ВИЧ-инфекции. Растворимый белок Fas может быть обнаружен в сыворотке крови, и его уровень может быть использован в качестве серологического предиктора прогрессирования СПИДа. Белок FasL высоко экспрессируется на поверхности и в сыворотке CD4+T и CD8+ T клеток ВИЧ-инфицированных пациентов; макрофаг-ассоциированный белок FasL высоко экспрессируется в лимфоидной ткани ВИЧ-инфицированных пациентов, что коррелирует с уровнем тканевого апоптоза. Экспрессия белка-супрессора апоптоза FLIP была снижена после активации покоящихся Т-клеток, поскольку активированные лимфоциты подвергаются апоптозу у ВИЧ-инфицированных пациентов, и поэтому предполагается, что сниженная экспрессия белка-супрессора апоптоза FLIP коррелирует с Fas-индуцированной апоптотической восприимчивостью лимфоцитов.
У ВИЧ-инфицированных пациентов в апоптоз лимфоцитов вовлечен сигнальный путь TNF фактора некроза опухоли. Хотя ранее сообщалось, что Т-клетки периферической крови ВИЧ-инфицированных пациентов толерантны к апоптозу, индуцированному сигнальным путем TNF, последние сообщения показали восприимчивость к апоптозу, индуцированному TNFR1 и TNFR2 в CD4+ T и CD8+ T-клетках, и этот апоптотический путь передачи и TNFR1-ассоциированный домен смерти (TRADD), домен рецептора (TRADD), рецептор-интегрирующий белок (RIP) и TNFR-ассоциированный фактор 2 (TRAF2) экспрессии, но связан с даунрегуляцией экспрессии BCL-2. Во время апоптоза сшивание рецепторов смерти приводит к активации ряда белков каспаз, включая инициатор апоптоза каспазу-8 и эффекторную каспазу-3. Обе эти активные формы каспазных белков экспрессируются в CD4+T и CD8+T лимфоцитах ВИЧ-инфицированных лиц, причем последняя индуцируется in vitro различными белками, кодируемыми ВИЧ, такими как Tat, Env, Nef и Vpr; другой каспазный белок, ICE, также обнаруживается в CD4+T клетках ВИЧ-инфицированных лиц. Исследования показали повышенную активность каспазы-3 у пациентов с прогрессирующей ВИЧ-инфекцией, что позволяет предположить корреляцию между экспрессией каспазы in vivo и патогенезом ВИЧ. Исследования показали, что TNFR-опосредованный апоптоз участвует в апоптозе CD8+ Т-клеток, и что связывание белка Env ВИЧ-вируса и молекул CXCR4 повышает экспрессию TNFR2, что приводит к апоптотической восприимчивости CD8+ Т-клеток. У пациентов с ВИЧ уровень TNF в сыворотке крови значительно повышен, а уровень растворимого TNFR2 в сыворотке крови может быть повышен, и последний может использоваться в качестве прогностического маркера прогрессирования заболевания ВИЧ. TRAIL — еще один лиганд, индуцирующий апоптоз, связанный с TNF, который также вовлечен в ВИЧ-ассоциированный апоптоз Т-клеток, и исследования показали, что Т-клетки ВИЧ-инфицированных пациентов восприимчивы к TRAIL-опосредованному апоптозу; при использовании функции TRAIL антитела, антагонизирующие TRAIL, подавляют активационно-индуцированную гибель клеток.
У ВИЧ-инфицированных пациентов CD4+ Т-клетки повышают экспрессию белка FasL вследствие ВИЧ-инфекции и вирусных белков, таких как gp120, tat и nef, которые могут превращаться в клетки-киллеры для Fas-экспрессирующих клеток. Исследования in vitro показали, что FasL-экспрессирующие CD4+ Т-клетки могут убивать Fas-экспрессирующие CD8+ Т-клетки; FasL-экспрессирующие макрофаги также являются потенциальными убийцами Fas-экспрессирующих Т-клеток, и это убийство не контролируется молекулами MHC. Примечательно, что опосредованное макрофагами уничтожение в основном выбирает неинфицированные сторонние Т-клетки; ВИЧ-специфические CTL являются потенциальными убийцами Fas-экспрессирующих активированных лимфоцитов. У ВИЧ-инфицированных лиц вирусные CTL, специфичные к белку Nef, могут опосредовать перфорин- и Fas-опосредованную цитотоксическую активность. Таким образом, определенные ВИЧ-специфические эффекторные клетки наносят вред иммунной системе ВИЧ-инфицированных лиц, в первую очередь инфицированным клеткам, экспрессируя FasL, который осуществляет киллинг неинфицированных ВИЧ, Fas-экспрессирующих лимфоцитов, и такая ситуация сохраняется в иммунной системе ВИЧ-инфицированных лиц.
3. Роль апоптотических белков в ВИЧ-инфекции.
В процессе апоптоза участвуют многие белки, и три лиганда, индуцирующие смерть, играют важную роль в начале апоптоза, включая TNF, FasL и TRAIL.
Fas/FasL играет важную роль в иммунопатогенезе ВИЧ-инфекции. Уровни растворимого и цитозольно-связанного Fas/FasL значительно выше у инфицированных пациентов по сравнению с ВИЧ-неинфицированными, что коррелирует с прогрессированием заболевания СПИДом. У ВИЧ-инфицированных пациентов экспрессия молекулы Fas была повышена в CD4+ T и CD8+ T клетках; экспрессия FasL была повышена на поверхности моноцитов-макрофагов, Nk клеток, которые встречаются в периферической циркуляции и лимфатических узлах. Анализ микрочипов генов выявил повышенную экспрессию Fas/FasL в ВИЧ-инфицированных лимфатических узлах. По сравнению с неинфицированными клетками, ВИЧ-инфицированные клетки были более чувствительны к Fas-опосредованному апоптозу, но не составляли большую часть апоптоза in vivo. У ВИЧ-инфицированных пациентов большинство циркулирующих апоптотических мононуклеарных клеток периферической крови не экспрессируют Fas; ВИЧ-инфицированные макрофаги индуцируют апоптоз в Т-клетках ВИЧ-инфицированных пациентов, но не неинфицированных пациентов, что предполагает гипотезу эффекта «стороннего наблюдателя», то есть апоптоз, происходящий у ВИЧ-инфицированных Апоптоз, происходящий при ВИЧ-инфекции, включает неинфицированные клетки лимфоидной ткани, которые отвечают на инфекцию. Исследования показали, что CD4+ Т-клетки ВИЧ-инфицированных шимпанзе не индуцируют апоптоз посредством связывания Fas/FasL; однако CD4+ Т- и CD8+ Т-клетки шимпанзе, инфицированных вирусом SIV, экспрессируют молекулы Fas, а Т- и В-клетки экспрессируют повышенное количество FasL на своей поверхности. У не прогрессирующих ВИЧ-инфицированных лиц растворимый протеолиз Fas в периферической крови ниже, лимфоциты, экспрессирующие молекулы Fas/FasL, уменьшены, а чувствительность молекул Fas снижена. Одно исследование показало ослабление прогрессирования заболевания в острой фазе инфекции SIV после блокирования проводящего пути Fas с помощью моноклонального антитела к FasL.
Патогенез TNF-α в ВИЧ-инфекции и связанных с ней осложнениях, в частности в вирусной репликации ВИЧ и в опосредовании апоптоза CD4+ Т-клеток, был подробно изучен. Несколько исследований показали, что ингибирование проводящего пути TNF-α не выявило значительного иммунологического преимущества против вируса ВИЧ; вместо этого в ряде экспериментов были обнаружены значительные побочные эффекты, включая увеличение вирусной нагрузки. Кроме того, результаты клинических испытаний показали, что рекомбинантный TNF-α обладает значительными токсическими побочными эффектами и не может быть использован в качестве метода очистки латентного ВИЧ.
TRAIL, член суперсемейства TNF, опосредует апоптоз CD4+ Т-клеток при ВИЧ-инфекции и функционирует как в инфицированных, так и в неинфицированных Т-клетках, взаимодействуя с рецепторами смерти DR4 и DR5. ВИЧ-инфекция дендритных клеток и макрофагов приводит к повышению экспрессии TRAIL, который индуцирует апоптоз в неинфицированных сторонних Т-клетках. По сравнению с неинфицированными пациентами, сывороточные концентрации TRAIL в периферической крови были повышены у ВИЧ-инфицированных сторонних наблюдателей с повышенной экспрессией рецептора смерти моноцитов DR5. Экспрессия TRAIL плазматическими дендритными клетками в периферической крови ВИЧ-инфицированных прохожих индуцировала апоптоз CD4+ Т-клеток у неинфицированных, но не у ВИЧ-инфицированных прохожих. Повышенная экспрессия TRAIL и DR5 была обнаружена в лимфоидных тканях ВИЧ-инфицированных лиц; снижение уровня свободного TRAIL в периферической крови и снижение экспрессии TRAIL и DR5 CD4+ Т-клетками было обнаружено после начала лечения ВААРТ. Однако после начала лечения ВААРТ в лимфоидных тканях ВИЧ-инфицированных пациентов была обнаружена сниженная экспрессия TRAIL, но снижения экспрессии DR5 не наблюдалось.
Исследования in vitro показали, что лечение макрофагов ВИЧ-инфицированных пациентов рекомбинантным белком TRAIL привело к значительному снижению уровня ВИЧ-вирусов, что позволяет предположить, что рекомбинантный белок TRAIL может быть терапевтическим подходом к лечению ВИЧ-инфекции. Моноклональные антитела к рекомбинантному белку TRAIL и DR4 и DR5 в настоящее время используются в клинических испытаниях I и II фазы для терапии опухолей, вызывая апоптоз опухолевых клеток. Теоретически, иммунологическое лечение ВИЧ-инфицированных пациентов рекомбинантным белком TRAIL способно убивать ВИЧ-инфицированные клетки, но побочные CD4+ T-клетки также могут подвергаться апоптозу; исследования in vitro показали, что лечение ВИЧ-инфицированных пациентов с помощью PBL с использованием рекомбинантного белка TRAIL приводило к снижению количества вирусов ВИЧ, но изменений в количестве или функции лимфоцитов обнаружено не было.
Иммунная система организма стимулируется новыми антигенами, а ранее активированные, другие антиген-специфические иммунные клетки уменьшаются. Механизм включает апоптоз активированных иммунных клеток, известный как активационно-индуцированная клеточная смерть (АИКД). Хроническая активация иммунной системы при ВИЧ-инфекции характеризуется генерализованным увеличением лимфатических узлов, повышением уровня В-лимфоцитов, активированных Т-лимфоцитов, NK-клеток, антигенпрезентирующих клеток и гипергаммаглобулинемией. Исследования показали, что во время ВИЧ-инфекции происходит хроническая иммунная активация, например, снижение уровня циркулирующих активированных моноцитов (HLA-DR+), активированных CD8+ Т-клеток (CD38+) и CD4+ Т-клеток и прогрессирование заболевания ВИЧ-инфекцией. Хроническая иммунная стимуляция приводит к АИКД CD4+ Т-клеток через Fas-зависимые и независимые механизмы. Во время ВИЧ-инфекции АИКД не ограничивается CD4+ Т-клетками, но также действует на истощение CD8+ Т-клеток, что связано с экспрессией программированной смерти 1 (PD-1) активированными CD8+ Т-клетками во время ВИЧ-инфекции. .
Источники хронической иммунной стимуляции во время ВИЧ-инфекции разнообразны и включают, в частности, персистирующие вирусы, циркулирующие белки ВИЧ, оппортунистические инфекционные агенты и реактивацию других инфекционных агентов; снижение абсолютного количества регуляторных Т-клеток ассоциируется с хронической иммунной активацией во время прогрессирования заболевания при ВИЧ-инфекции. Недавние исследования показали, что истощение CD4+ Т-клеток в желудочно-кишечном тракте приводит к релокализации микроорганизмов и увеличению количества микробных компонентов в циркуляции, включая эндотоксины, бактериальную ДНК и т.д., которые ассоциируются с прогрессированием заболевания ВИЧ. Системная циркуляция микробных продуктов приводит к активации сигнальных путей Toll-подобных рецепторов, которые способствуют AICD желудочно-кишечных CD4+ Т-клеток, что приводит к снижению количества CD4+ Т-клеток. Системная циркуляция микробных продуктов также ингибирует пролиферацию и функцию Т-клеток через регуляцию экспрессии PD-1 и выработку IL-10.
4. ВИЧ-белки и апоптоз.
Gp120 — это гликопротеин, экспрессируемый геномом ВИЧ на плазматической мембране ВИЧ, который присоединяется к рецептору CD4 и корецепторам CXCR4 или CCR5, облегчая прикрепление вируса и проникновение в клетки. Мембранно-связанный и растворимый gp120 и CD4-рецепторы связываются, что приводит к апоптозу инфицированных и неинфицированных CD4+ Т-клеток. Исследования показали множество механизмов, вовлеченных в gp120-индуцированный апоптоз CD4+ Т-клеток: повышение экспрессии Fas, FasL и TNF-α, молекулярных мимиков Fas, повышение экспрессии TRAIL, DR4 и DR5, индукция остановки клеточного цикла в фазе G2, производство реактивных кислородных радикалов, снижение экспрессии BCL-2, фосфорилирование белков mTOR и p53, повышение экспрессии проапоптотического белка PUMA и активация белка P38. Хотя не ясно, какой механизм играет главную роль в ВИЧ-инфекции in vivo, ясно то, что молекула gp120 является плюрипотентной и может индуцировать апоптоз в CD8+ Т-клетках, эндотелиальных клетках сосудов, нейронах, кардиомиоцитах, тубулярных клетках почек, гепатоцитах и т.д.
Tat — это транс-активирующий белок ВИЧ, который способствует транскрипции длинных терминальных повторов ВИЧ и плейотропно влияет на апоптоз CD4+ Т-клеток. Белок tat вырабатывается на ранней стадии жизненного цикла вируса и может секретироваться ВИЧ-инфицированными клетками и поглощаться неинфицированными клетками посредством клатрин-опосредованного эндоцитоза. Исследования показали, что белок Tat может оказывать апоптотическое и антиапоптотическое действие in vitro в зависимости от используемых клеток, эндогенного вектора экспрессии и дозы белка Tat. Обработка неинфицированных Т-клеток Jurkat низкими дозами белка tat приводила к толерантности к апоптозу, индуцированному молекулами TNF, Fas и TRAIL, снижению экспрессии каспазы 10 и повышению экспрессии Bcl-2 и c-FLIP. Обработка неинфицированных Т-клеток и мононуклеарных клеток высокими дозами белка tat увеличивала экспрессию молекул Fas, каспазы 8, Bax и RCAS-1 и способствовала апоптозу. Белок tat также присоединялся к внутриклеточным микротрубочкам, приводя к их изменению и Bim-опосредованному митохондрий-зависимому апоптозу. Механизм индукции или ингибирования Tat апоптоза у ВИЧ-инфицированных пациентов пока не понятен. Tat присутствует в организме в антиапоптотических сывороточных концентрациях; обработка моноцитов и макрофагов ВИЧ-инфицированных пациентов белком Tat приводит к повышенной экспрессии молекул TRAIL, которые индуцируют апоптоз в неинфицированных «сторонних» Т-клетках; однако Т-клетки шимпанзе, обработанные белком Tat, антагонизируют tat-опосредованный апоптоз.
Vpu — это кодируемый геномом ВИЧ белок-помощник, который снижает экспрессию рецепторов CD4, предотвращает дальнейшее заражение инфицированных CD4+ Т-клеток и позволяет новообразованному вирусу «распускаться» в цитозоле. Высокая экспрессия белка Vpu в Т-клетках Jurkat приводит к повышенной восприимчивости к Fas-опосредованному апоптозу, что связано с подавлением внутриклеточной NF-κB-опосредованной антиапоптотической экспрессии генов в ВИЧ-инфицированных клетках, экспрессирующих молекулы Vpu. Удаление компонента Vpu из вирусной структуры ВИЧ NL4-3 уменьшало истощение CD4+ Т-клеток. Было показано, что белки Vpu из разных вирусных подтипов ВИЧ имеют разную скорость истощения CD4+ Т-клеток.
Белок Nef — многофункциональный белок, кодируемый вирусным геномом ВИЧ, который экспрессируется в основном на ранних стадиях жизненного цикла вируса и отвечает за снижение экспрессии рецепторов CD4 и молекул MHC-I, одновременно усиливая вирусную репликацию. Т-клетки, экспрессирующие белок Nef, повышают уровень экспрессии молекул Fas и FasL, снижают экспрессию Bcl-2 и Bcl-XL, повышают экспрессию молекулы PD-1 и вызывают апоптоз через каспазозависимый и независимый пути. Белки Nef, продуцируемые инфицированными CD4+ Т-клетками, вызывают повышенную проницаемость лизосом и высвобождают катепсин D в цитоплазму, что впоследствии приводит к разрыву внешней мембраны митохондрий. Молекулы Nef, действующие на неинфицированные CD4+ Т-клетки, могут приводить к апоптозу по механизму, который еще не изучен, но может быть связан с действием CXCR4 и SDF-1α.
5. Апоптоз иммунных клеток и иммунное повреждение.
5.1 Апоптоз CD4+ Т-клеток и иммунное повреждение в.
CD4+ Т-клетки обычно рассматриваются как хелперные Т-клетки иммунной системы, способствующие выработке гуморального и клеточного иммунитета, а также антител и CD8+ CTL. При встрече с антигенами хелперные Т-клетки дифференцируются в эффекторные клетки, которые выделяют высокий уровень γ-ИФН, ИЛ-4, ИЛ-10 и других иммуномодулирующих молекул. Наиболее яркой особенностью ВИЧ-инфекции является отсутствие ВИЧ-специфических CD4+ Т-клеток. Пролиферация ВИЧ-специфических CD4+ T-клеток, которая происходит после того, как антиретровирусная терапия контролирует вирусную нагрузку, подтверждает важную роль эффекторных клеток CD4+ T; это также подтверждает быструю потерю ВИЧ-специфического ответа CD4+ T-клеток во время острой фазы ВИЧ-инфекции. Эту потерю можно объяснить несколькими механизмами: ВИЧ-специфические предшественники CD4+ Т-клеток уничтожаются в лимфатических узлах после связывания ВИЧ-вируса с рецептором хоминга CD62L; когда естественные предшественники CD4+ Т-клеток рекрутируются в инфицированную лимфоидную ткань, они погибают под руководством ВИЧ-инфицированных дендритных клеток. Таким образом, во время острой ВИЧ-инфекции быстро пролиферирующие ВИЧ-специфические CD4+ T-клетки памяти очень восприимчивы к ВИЧ-инфекции, и они несут больше вирусной ДНК, чем другие CD4+ T-клетки памяти, что позволяет предположить, что ВИЧ преимущественно инфицирует CD4+ T-клетки, что приводит к их последующему преимущественному уничтожению; разрушение активированных ВИЧ-специфических CD4+ T эффекторных клеток опосредуется FasL и Низкий уровень ВИЧ-специфических CD4+ T клеток у ВИЧ-инфицированных пациентов связан с высоким уровнем виремии, их «неспособностью» взаимодействовать с дендритными клетками периферической крови или их подавлением CD4+CD25+ регуляторными T клетками. «Неспособность» связана с подавлением взаимодействия дендритных клеток периферической крови или регуляторными Т-клетками CD4+CD25+.
Во время иммунного ответа Т-клетки дифференцируются на два основных класса: Th1-клетки, которые выделяют в основном γ-ИФН, и Th2-клетки, которые выделяют ИЛ-4, причем Th1-клетки играют важную роль в противовирусном CTL-ответе. Многие цитокины влияют на трансформацию Naïve Т-клеток в Th1-клетки, такие как IL-12 и γ-IFN, первый происходит из активированных патогеном макрофагов или дендритных клеток, а второй — из активированных патогеном NK-клеток, которые важны для дифференцировки Naïve Т-клеток. ВИЧ-инфекция вызывает изменения в структуре секреции цитокинов. Прогрессирование ВИЧ-инфекции сопровождается снижением секреции IL-2, IL-12 и γ-IFN мононуклеарными клетками периферической крови и увеличением секреции IL-4 и IL-10, что указывает на снижение количества CD4+ Т-клеток и прогрессирование заболевания. Анализ Т-клеток периферической крови ВИЧ-инфицированных пациентов после стимуляции in vitro и краткосрочной культуры показал значительное снижение количества IL-2-секретирующих Т-клеток и увеличение количества γ-IFN-продуцирующих γ-IFN-продуцирующих Т-клеток, сохраняющееся на протяжении всего течения ВИЧ-инфекции. Среди различных подклассов Th1 клеток определенные подклассы были восприимчивы к активационно-индуцированной гибели клеток (AICD), которая регулируется клеточной экспрессией белка BCL-2. Прогрессирующее снижение количества IL-2-продуцирующих Т-клеток коррелирует как с восприимчивостью к апоптозу, так и с прогрессированием заболевания. Эти данные позволяют предположить наличие корреляции между увеличением AICD Т-клеток периферической крови и ВИЧ-специфическим иммунным повреждением во время ВИЧ-инфекции.
5.2 Измененная дифференцировка CD8+ Т-клеток.
У ВИЧ-инфицированных пациентов ВИЧ стимулирует выработку сильного ответа CD8+ CTL. Во время острой инфекции ответы CTL и вирусная нагрузка в периферической крови увеличиваются; когда ответы CTL достигают пика, уровень вируса снижается; при хронической инфекции обнаруживается отрицательная корреляция между ответами CTL и вирусной нагрузкой. cd8+CTL играют важную роль в контроле виремии ВИЧ, и исследования на шимпанзе показали, что истощение CD8+ T-клеток после инфекции SIV также не помогло контролировать ВИЧ-инфекцию. Анализ вирусспецифических CTL in vitro показал, что ВИЧ-специфические недостатки в функции CTL нарушают их способность контролировать вирус. Хотя ВИЧ-специфические CD8+ CTL продуцируют противовирусные молекулы, такие как γ-IFN и CCL4, подавляющее большинство CTL экспрессируют низкий уровень перфорина и не способны эффективно убивать клетки-мишени. Измененная дифференцировка CTL связана с повышенным апоптозом, а дифференцированные подклассы CD8+ CTL имеют разную восприимчивость к Fas-индуцированному апоптозу; бедная цитокиновая среда in vivo пагубно влияет на выживание клеток. Кроме того, неспособность CTL контролировать ВИЧ-инфекцию также связана с иммунорегуляторными Т-клетками, поскольку исследования показали, что ВИЧ-антиген индуцирует секрецию TGF-β регуляторными CD8+ Т-клетками (Regulatory CD8+T) и снижает γ-IFN ответ ВИЧ-специфических CD8+ Т-клеток. Таким образом, активационно-индуцированная клеточная гибель (AICD) и ингибирующие цитокины являются важными механизмами дефектов дифференцировки CD8+ CTL.
6. Апоптоз Т-клеток и прогрессирование заболевания СПИДом.
Исследования на ВИЧ-инфицированных пациентах и животных моделях SIV-инфекции показали корреляцию между интенсивностью апоптоза Т-клеток и прогрессированием СПИДа. Во-первых, уровень апоптоза Т-клеток был ниже у людей с длительно не прогрессирующей ВИЧ-инфекцией; во-вторых, исследования в Западной Африке показали, что ВИЧ-2 инфекция, которая менее патогенна, чем ВИЧ-1, характеризуется низким уровнем иммунной активации и сниженным апоптозом Т-клеток; в-третьих, при сравнении вирусных инфекций ВИЧ-1 и ВИЧ-2 с аналогичным истощением CD4+ Т-клеток было обнаружено, что иммунная активация и истощение CD4+ Т-клеток коррелируют; в-четвертых, при сравнении животных моделей лентивирусной инфекции с контрольными моделями животных было обнаружено, что в животных моделях лентивирусной инфекции происходит апоптоз лимфоцитов. Исследования на животных моделях SIV-инфекции шимпанзе показали прогрессивное снижение CD4+ Т-клеток, связанное с высокой вирусной нагрузкой, высокой иммунной активацией и повышенным апоптозом CD4+ Т-клеток. Исследования на мышиных исследовательских моделях показали важную роль хронической иммунной активации в Т-клеточном иммунодефиците. Создание трансгенных мышей, экспрессирующих молекулы CD70, которые могут постоянно экспрессироваться в ответ на антигенную стимуляцию, может вызвать клинические признаки, сходные с ВИЧ-инфекцией, т.е. прогрессивное преобразование Naïve Т-клеток в эффекторные Т-клетки, что приводит к истощению пула Naïve Т-клеток и в конечном итоге к апоптозу вследствие оппортунистической инфекции. В заключение, приведенные выше экспериментальные результаты дают дополнительные доказательства того, что хроническая иммунная активация может быть основной причиной аномальной функции CD4+ Т-клеток и апоптоза — основного патологического молекулярного механизма прогрессирования СПИДа.
7. Вирусологическое уклонение от апоптоза.
Ингибирование апоптоза способствует продукции дочерних вирусных частиц ВИЧ, а некоторые продукты генов ВИЧ-вирусов обладают анти-ВИЧ вирусной активностью. Белки nef, gp120 и Vpu способствуют даунрегуляции экспрессии молекулы CD4 в ВИЧ-инфицированных клетках и предотвращают апоптоз, опосредованный молекулой gp120-CD4. Белки nef даунрегулируют экспрессию молекулы MHC-I и повышают экспрессию молекулы fasL, эта стратегия защищает инфицированные клетки от гибели CTL и NK-клетками. Низкая экспрессия вирусного белка Vpr вызывает повышение экспрессии BCL-2 и снижение экспрессии BAX, тем самым подавляя апоптоз. Белок tat снижает транскрипцию белка TP53, способствует прогрессии клеточного цикла, подавляет апоптоз и способствует производству большого количества вирусных частиц инфицированными клетками. В лимфатических узлах ВИЧ-инфицированных пациентов апоптоз in vivo происходил в основном в неинфицированных клетках-сторонниках, что позволяет предположить непрямой молекулярный механизм апоптоза; это также свидетельствует о наличии апоптотических CD8+ CTL, B-клеток и дендритных клеток в лимфоидной ткани ВИЧ-инфицированных пациентов. Напротив, ВИЧ-инфицированные клетки менее восприимчивы к апоптозу, что свидетельствует о толерантности к ВИЧ-индуцированному клеточному киллингу. Таким образом, вирус ВИЧ обеспечивает собственное выживание, контролируя апоптотические механизмы до того, как они будут активированы и приведут к разрушению иммунной системы.