В 1997 году, после публикации профессором Данни’сЛо из Университета Центрального Гонконга в Оксфорде работы «Значительная доля клеточно-фетальной ДНК (cffDNA) в плазме крови беременных женщин», исследования на эту тему приобрели массовый характер и стали академической областью пренатальной диагностики. В последние годы, с появлением тестов второго поколения, использование кффДНК стало важной частью академической области пренатальной диагностики. В последние годы, с быстрым развитием инструментов секвенирования следующего поколения (NGS), неинвазивное пренатальное тестирование (НИПТ) официально применяется в клинической практике как метод пренатального тестирования хромосомных аномалий плода. Традиционно хромосомные аномалии выявляются в два этапа: пренатальный скрининг и пренатальная диагностика. Пренатальный скрининг предполагает использование неинвазивных методов, таких как материнские биохимические маркеры и ультразвуковые маркеры плода, для оценки риска хромосомных аномалий в первом или втором триместре. Для беременных женщин с высоким риском хромосомных аномалий плода рекомендуется второй этап дородовой диагностики, который включает инвазивный тест, такой как амниоцентез или хориониквиллусамплинг (CVS) для подтверждения нормального кариотипа плода. Общепринятый пренатальный скрининг имеет чувствительность около 85% и специфичность 95%, т.е. 15% хромосомных аномалий плода не выявляются, и почти в 5% случаев необходимо проводить дальнейшую инвазивную диагностику, которая может привести к аборту и инфекции. Почти в 5% случаев необходимо пройти дальнейшую инвазивную пренатальную диагностику, которая может привести к выкидышу и инфекции. НИПТ — это неинвазивный метод забора материнской крови и применения NGS для прямого анализа плазменной ДНК плода (а не косвенных биометаболических маркеров) на наличие распространенных хромосомных аномалий плода, включая трисомию 21, трисомию 18 и трисомию 13. С чувствительностью 98% и специфичностью более 99%, НИПТ был определен как прогрессивная альтернатива традиционному двухэтапному тесту на хромосомные аномалии плода от пренатального скрининга до пренатальной диагностики, и описан как скрининговый тест диагностического уровня. Основной принцип НИПТ заключается в сравнении неполных фрагментов свободной ДНК (в среднем 50-200 оснований) в периферической плазме беременной женщины, в основном из клеток ее собственной ткани и в меньшей степени из апоптоза клеток плацентарного трофобласта, с большой базой данных 36-базовых нуклеотидных последовательностей, уже установленных в приборе NGS, с использованием массивно-параллельного метода. Метод массивно-параллельного секвенирования (MPS) используется для идентификации фрагментов ДНК различного хромосомного происхождения (без различия между фрагментами материнской и плацентарной ДНК), а затем логически и статистически анализируется, представлены ли фрагменты ДНК определенного хромосомного происхождения в избытке. Хромосомной анеуплоидией считается Zscore более 3 или normalizedchromosomevalues (NCVs) более 4 при использовании наиболее часто используемых процедур анализа. Фрагменты свободной фетальной ДНК в клетках NIPT в основном принадлежат плацентарным клеткам. Во время ранней беременности, после формирования плаценты, клетки трофобласта продолжают метаболизировать и умирать, а фрагменты ДНК продолжают поступать в материнскую циркуляцию. Период полураспада свободных фрагментов фетальной ДНК составляет всего 16 мин, и через 2 ч после родов не было обнаружено ни одного свободного фрагмента фетальной ДНК от этой беременности. Фетальная фракция свободных фрагментов ДНК в материнской плазме составляет в среднем 10,2% на 10 неделе беременности и медленно увеличивается со скоростью 0,11% в неделю до 20 недели беременности, когда фетальная фракция снова увеличивается с более значительной скоростью. Для точного теста НИПТ фетофракция свободных фрагментов ДНК в плазме крови беременной женщины должна составлять не менее 4%, что означает, что большинство беременных женщин готовы к проведению НИПТ в 10 недель беременности, что дает преимущество раннего пренатального тестирования перед другими видами пренатального скрининга или пренатальной диагностики. Помимо количества недель беременности, вес матери, этническая принадлежность, сывороточные маркеры, курение и кариотип также являются факторами, которые влияют на соотношение плода и, следовательно, прямо или косвенно влияют на чувствительность и специфичность теста NIPT. Кроме того, поскольку основным источником свободной ДНК материнской плазмы является плацента, тест NIPT теоретически должен быть аналогичен образцу ворсинок хориона, и поэтому может возникнуть ложноположительное или ложноотрицательное заключение о кариотипе, аналогичное образцу ворсинок хориона. Предварительные статистические данные показывают, что процент ложноположительных результатов НИПТ составляет приблизительно 0,1% — 0,2%. Однако неизвестно, какую долю несоответствия между результатами НИПТ и результатами кариотипа плода можно отнести на счет схемы статистического анализа алгоритма отнесения между хромосомной гаплоидией (эуплоидией) и хромосомной анеуплоидией, а какую долю можно отнести на счет различий в интерпретации генов из-за чувствительности секвенирования MPS. Ограниченный плацентарный мозаицизм (ОПМ) часто называют причиной ложноположительных результатов НИПТ. Приблизительно от 1% до 2% плацент в первом триместре беременности имеют ЦПМ. В некоторых случаях, как полагают, ЦПМ, обнаруженная при взятии проб ворсин хориона, связана с ложноположительными результатами НИПТ, а Меннути и др. представили два случая ЦПМ, связанных с результатами НИПТ по трисомии 13, der(13,13) (q10;q10), и соответствовал результатам НИПТ. Холл и др. предположили, что в случае результатов НИПТ, свидетельствующих о трисомии 13, интерфазная ядерная флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и обычный анализ культуры хромосом показали химерную хромосому 13 (47,XY,+13/46,XY). В данном случае плод родился с задержкой роста, но без признаков трисомии хромосомы 13, а хромосомный анализ крови новорожденного показал нормальный кариотип — 46,XY. Другим интересным случаем является однородительская диплоидия (UPD), когда механизм дисомного спасения приводит к сохранению одной пары хромосом от одного из двух родителей. В случае NIPT с трисомией хромосомы 21, QF-PCR на 14 неделе беременности была проведена на хорионическом ворсине для исследования семи коротких тандемных повторов (STR) на хромосоме 21, которые, как было установлено, принадлежали к UPD хромосоме 21 матери. Остальные три теста были на трисомию хромосомы 21. ЦПМ часто регистрируется в сочетании с задержкой роста плода, поэтому при подозрении или подтверждении ЦПМ в данном случае после НИПТ следует назначить подробное серийное УЗИ плода антенатально для оценки биофизиологического состояния плода, а после рождения — для текущей оценки веса и кривой роста. Кариотип UPD является одним из сценариев, который следует рассматривать, когда результаты НИПТ не согласуются с кариотипом плода. Кроме того, в случаях, когда тест NIPT не отражен в обычном кариотипе или когда эти два результата несовместимы, исследование микрочипов может еще больше раскрыть тайну. Помимо трех основных хромосомных трисомий, другие хромосомы также могут выявлять заболевания ЦПМ. В большом исследовании беременных женщин в китайской популяции один случай НИПТ позволил предположить множественную хромосомную анеуплоидию: 47,XXY, трисомию хромосомы 21 и трисомию хромосомы 17. В другом случае результаты НИПТ позволили предположить трисомию 22; после родов у новорожденного была обнаружена нормальная двойная хромосома 22 в кариотипе пуповинной крови и трисомия хромосомы 22 в трех частях плацентарного кариотипа. После рождения у плода наблюдалась задержка роста, но признаков хромосомных аномалий не было. В случаях расхождения результатов НИПТ и кариотипа плода важно рассмотреть вопрос о том, являются ли причиной этого физиологические факторы матери. Это может включать материнскую хромосомную анеуплоидию, которая обычно возникает при аномалиях половых хромосом, или состояния с внутренними генетическими изменениями, такие как солидные опухоли. Первое сообщение о случае материнской анеуплоидии половых хромосом (SCA) произошло у нормальной 25-летней беременной женщины с результатами НИПТ, свидетельствующими о трисомии Х-хромосомы. Дальнейшее кариотипирование амниотической жидкости показало нормальный 46,XX, и новорожденный родился с нормальным развитием. Дальнейшее обследование кариотипа материнской крови выявило полный 47,XXX, что является примером значительной вариабельности в проявлении анеуплоидии половых хромосом. В другом случае с 44-летней женщиной с химеризмом с аномалией половой хромосомы тест NIPT показал аномальное соотношение Х-хромосом, которое не соответствовало соотношению Х-хромосом ранее диагностированного случая 45,Х в этом центре. Дальнейшее кариотипирование беременной показало, что у нее 45,X/46,XX, а новорожденный родился с нормальным кариотипом. Wang и др. разработали быстрый анализ кариотипа по методу MPS, наряду с тестированием материнских лейкоцитов, для оценки химеризма кариотипа материнского пола, когда результаты НИПТ не соответствовали SCA. Из 181 случая положительного теста на SCA при проведении НИПТ дальнейший анализ показал, что 16 (8,6%) случаев были обусловлены материнским химеризмом Х-хромосомы. Можно предположить, что СЦА, особенно химерные, могут приводить к противоречивым результатам с плодом при НИПТ-тестировании, что может быть недооценено в клинической практике. Применение НИПТ для интерпретации как SCA должно предусматривать адекватное обсуждение до тестирования и полное генетическое консультирование после тестирования. Другим источником ДНК, который может создавать помехи и приводить к противоречивым результатам НИПТ, является материнская паренхимальная опухоль. В представленном случае НИПТ была проведена на 13 и 17 неделях беременности, результаты показали трисомию 13 и моносомию 18, а кариотипирование амниотической жидкости плода показало нормальный 46,XY. После родов пациентка была обследована по поводу тазовой боли, и в полости таза была обнаружена метастатическая нейроэндокринная злокачественная опухоль, которая впоследствии была диагностирована как мелкоклеточная карцинома влагалищного происхождения. Флуоресцентное гетерозиготное окрашивание раковых клеток in situ показало, что большинство раковых клеток (80%) имели более высокую интенсивность флуоресценции на хромосоме 13, чем на хромосоме 18, что соответствовало результатам НИПТ. Неизвестно, какая доля раковых заболеваний у беременных женщин будет зарегистрирована как аномальные при проведении НИПТ, но возможность множественной хромосомной анеуплоидии при проведении НИПТ не следует сбрасывать со счетов в клинической практике. Немногочисленные случаи ложноотрицательных результатов из-за несовпадения кариотипов НИПТ и хромосом, о которых сообщалось в клинической практике, позволяют предположить, что они могут быть связаны с неправильным обращением с тестом, соотношением свободных фрагментов ДНК плода в материнской плазме или химеризмом. Клиническая и коммерческая реализация НИПТ быстро развивается, и он становится рутинной частью дородового тестирования для акушеров. Однако поставщики НИПТ не имеют полной информации обо всех случаях ложноположительных и ложноотрицательных результатов из-за несоответствия НИПТ и кариотипа со стороны клинициста. Доля ложноположительных и ложноотрицательных результатов при проведении НИПТ должна быть выше, чем реальная частота. Кроме того, блок тестирования NIPT не предоставляет количественный анализ теста клинической стороне для регрессионного анализа фона ложноположительных и ложноотрицательных случаев. В будущем использование NIPT может быть распространено с нынешней группы высокого риска на все группы низкого риска, и ожидается, что ложноположительный статус тестов NIPT будет более значительным при таком сценарии. Возможным решением является разработка совместной системы регистрации и отслеживания случаев НИПТ между тестирующим и клиническим сообществами. С помощью этой системы положительные случаи NIPT можно сравнить с результатами кариотипа, а отрицательные случаи NIPT можно сравнить с клиническими результатами, используя информацию, предоставленную врачами и записями о рождении. Система отслеживания регистрации также выявляет ложноположительные и ложноотрицательные показатели НИПТ с помощью опросов и анализов. Для подтвержденных ложноположительных случаев НИПТ могут быть проведены дополнительные тесты CPM, UPD и микрочипов генов. Данные анализа единиц измерения, фетального соотношения свободных фрагментов ДНК в материнской плазме и сбора материнских и неонатальных данных могут быть использованы для дальнейшего изучения истинных причин ложноположительных НИПТ и улучшения чувствительности и специфичности теста НИПТ.