Преамбула: Пренатальная диагностика генетических заболеваний обычно требует генетического тестирования члена семьи, который является заранее определенным случаем (человеком с генетическим заболеванием). После обнаружения мутировавшего локуса беременные женщины, которые подвержены риску рождения еще одного ребенка в семье, должны пройти процедуру хорионического ворсина или амниоцентеза на определенном сроке беременности для определения повторного заражения плода аналогичным заболеванием. Однако в некоторых случаях семья может оказаться не в состоянии поставить пренатальный диагноз, поскольку заболевание было слишком тяжелым и смерть наступила слишком рано после рождения (смерти) для проведения окончательного генетического тестирования.
Генетическое отделение кафедры дерматологии Первой больницы Пекинского университета имеет долгую историю пренатальной диагностики наследственных кожных заболеваний и накопило богатый опыт в области генетического тестирования и пренатальной диагностики. При отсутствии результатов генетического тестирования предрасположенных родителей можно также сделать вывод о генетических дефектах предрасположенных родителей путем прямого генетического тестирования родителей-носителей, что позволяет успешно провести точную пренатальную диагностику для повторного зачатия ребенка. В приведенной ниже статье, подготовленной группой исследователей генетической дерматологии, включая Линь Чжимяо из отделения дерматологии Первой больницы Пекинского университета, подробно описывается процесс тестирования.
Коллодийный ребенок (КР) — это новорожденный ребенок, родившийся с напряженной, студенистой мембраной, покрывающей все тело, что может сопровождаться гиперемией кожи по всему телу. В результате натяжения кожи на теле у ребенка могут развиться такие деформации, как эктропион век, эктропион губ, редкие волосы, деформация хрящей ушей и сгибание пальцев рук и ног [1]. ХБ может быть вызван различными генетическими заболеваниями кожи, наиболее распространенным из которых является аутосомно-рецессивный врожденный ихтиоз (ARCI) [2]. Пренатальная диагностика включает определение локуса мутации причинного гена у пациента или семейного носителя, а затем получение образцов тканей плода путем пункции ворсин хориона или амниоцентеза во время беременности для анализа соответствующего локуса мутации с целью определения наличия у плода семейного наследственного заболевания [3]. Мы успешно провели пренатальную диагностику у двух пар, родивших ребенка, похожего на керосиновую жвачку, путем исключения генов-кандидатов.
Предметы и методы
I. Субъекты
Семья 1, здоровая пара, обратившаяся в нашу клинику наследственной дерматологии за консультацией по поводу двух родов СВ. Оба СВ после рождения были покрыты полупрозрачной желатиновой субстанцией, с эктропионом век и гиперемией по всему телу, а примерно через 3 недели субстанция начала отпадать, с некоторыми везикулами и сочащимися выделениями, вместе с септической инфекцией кожи и лихорадкой. В клинику обратилась семья 2, здоровая пара, у которой шесть месяцев назад родился ребенок. После рождения у младенца также наблюдалась генерализованная гиперемия и напряженные мембранозные образования, эктропион век и редкие волосы. Через несколько дней после рождения младенец умер в течение недели из-за трудностей с кормлением, вторичной инфекции и водно-электролитных нарушений. История ХБ в обеих семьях была описана родителями самостоятельно (ни один из них не смог предоставить фотографии ребенка), а диагноз ХБ был поставлен дерматологом в роддоме. У обеих пар была совершенно нормальная кожа, не было никаких ихтиозоподобных поражений, они отрицали кровосмесительный брак, и в остальном в их семьях были похожие пациенты. Нам не удалось получить образцы фетальной ткани, так как оба плода умерли вскоре после рождения.
II. Методы
1. выделение ДНК: 5 мл периферической крови от каждого родителя больных детей в обеих семьях были взяты, антикоагулированы 2% ЭДТА, и геномная ДНК была выделена с помощью гипотонического гемолиза, а также с помощью фенол-хлороформной экстракции.
2. ПЦР-амплификация генов TGM1, NIPAL4 и ALOX12B и секвенирование ДНК: специфические праймеры были разработаны в соответствии с последовательностями генов и использованы для амплификации кодирующих областей вышеуказанных генов и их фланкирующих последовательностей. Исходя из частоты встречаемости причинных генов у пирогенных младенцев, предполагаемые причинные гены тестировались у каждого родителя пораженного ребенка, пока у обоих родителей не обнаруживались причинные локусы мутации в одном и том же причинном гене. Патогенность мутировавших локусов была предсказана с помощью онлайн-программы Mutationtaste (http://www.mutationtaster.org/), а выявленные мутировавшие локусы были ранжированы среди 200 неродственных нормальных ДНК.
3. Пренатальная диагностика: в семье 1 у матери, перенесшей заболевание, была взята пункция ворсин хориона на сроке 11 недель беременности, и после выделения ДНК хориальной ткани плода была проведена ПЦР для амплификации и последовательности экзонов патогенного локуса гена TGM1. В семье 2 мать прошла амниоцентез на 18 неделе беременности, и некоторые клетки амниотической жидкости были использованы для прямого выделения ДНК, амплификации экзона локуса патогенности ALOX12B и секвенирования; некоторые клетки амниотической жидкости были использованы для культуры, и после того, как клетки амниотической жидкости окостенели, жидкость была заменена, чтобы удалить загрязнение от взвеси крови матери, и культивированные клетки амниотической жидкости были выделены для повторной амплификации ДНК и секвенирования экзона локуса патогенности ALOX12B. ДНК культивированных клеток амниотической жидкости была амплифицирована и повторно секвенирована для экзонирования патогенного локуса гена ALOX12B.
Результаты
I. Локусы мутации патогенного гена
Мы обнаружили гетерозиготную мутацию в гене TGM1 c.C427T в геномной ДНК отца семьи 1, которая привела к аминокислотной замене p.Arg143Cys в кодируемом белке трансглутаминазы 1, высококонсервативный сайт мутации, о котором ранее сообщалось у пациентов с ламеллярным ихтиозом. Гетерозиготная мутация delG, приводящая к мутации сдвига в кодирующем белке p.G369fsX13 и раннему стоп-кодону на аминокислоте 13 ниже по течению от мутировавшей аминокислоты, что приводит к появлению усеченного белка. В генах TGM1 и NIPAL4 родителей ребенка из семьи 2 не было обнаружено патогенных мутаций. У отца ребенка была гетерозиготная мутация c.1463G>A в гене ALOX12B, приводящая к замене аминокислоты p.Arg488His в кодируемом белке, а у матери — гетерозиготная мутация c.1642C>T в гене ALOX12B, приводящая к замене аминокислоты p.Arg548Trp в кодируемом белке; обе мутации были зарегистрированы у младенцев с керосиноподобным заболеванием Оба участка мутации были зарегистрированы у G. pyrifera-подобных младенцев и являются высококонсервативными аминокислотными локусами. Все четыре мутировавших локуса были предсказаны Mutationtaste как вызывающие заболевание и не были замечены у 200 нормальных людей.
II. Пренатальная диагностика
Плод был признан здоровым после ПЦР-амплификации и секвенирования ДНК после пункции ворсин хориона на 11 неделе беременности. В семье 2 ПЦР-амплификация и секвенирование ДНК образцов амниоцентеза, взятых на 18 неделе беременности у матери, показали, что плод несет отцовский локус мутации c.1463G>A для ALOX12B, а материнский локус мутации c.1642C>T отсутствует. Повторное тестирование после культивирования клеток амниотической жидкости было последовательным, и плод был определен как здоровый носитель. При последующем наблюдении оба плода родились здоровыми новорожденными.
ДИСКУССИЯ
ХБ может наблюдаться при различных генетических заболеваниях кожи, наиболее распространенным из которых является ARCI [1]. CB также может наблюдаться при различных синдромальных и несиндромальных ихтиозах, метаболических нарушениях, таких как болезнь Гоше, и других состояниях, таких как эктодермальная дисплазия [4, 5]. Тяжелый клинический фенотип ламеллярного ихтиоза [2]. Однако в первые годы жизни ХБ может страдать от значительного увеличения транскутанной потери воды из-за сильно нарушенной барьерной функции кожи, что приводит к терморегуляторному дисбалансу, водно-электролитным нарушениям и увеличению вероятности инфекции из-за повреждения кожи, что делает ХБ очень смертельным в этот период при отсутствии надлежащего ухода [1]. Все трое детей с ХБ в двух семьях данного исследования умерли вскоре после рождения, что может быть связано с высоким уровнем смертности на ранних стадиях ХБ и отсутствием опыта ухода в местных больницах. Окончательный диагноз заболевания в то время не был поставлен ни в одной из семей из-за ранней смерти ребенка, невозможности получить образцы кожной ткани для патологоанатомического и гистохимического исследования, а также невозможности понять дальнейшие клинические проявления заболевания.
Пренатальная диагностика генетических нарушений обычно требует идентификации локуса мутации причинного гена либо у ранее существовавшего пациента, либо у самого пациента с последующим тестированием клеток амниотической жидкости плода или образцов ткани ворсин хориона при риске рецидива на соответствующий локус для определения генотипа плода и, следовательно, наличия у плода заболевания [3, 7]. Поскольку в данном исследовании ДНК пациента не была доступна ни для одной из семей, поиск локусов патогенных мутаций можно было проводить только в ДНК родителя с установленным носительством. Поскольку ХБ наиболее часто ассоциируется с ARCI, мы сначала предложили провести скрининг родителей детей в обеих семьях на наличие шести генов, вызывающих ARCI. В отсутствие характерного клинического фенотипа для выбора из шести патогенных генов, мы проверили каждый из шести генов в порядке убывания в соответствии с долей шести генов, которые, как сообщалось, вызывают ARCI на основе литературного поиска (TGM1>NIPAL4>ALOX12B>CYB4F22>ABCA12>ALOXE3) [8], пока не был идентифицирован патогенный ген. Мы считали ген причинным геном, вызывающим пирогенное камедетечение в семье, только в том случае, если у обоих родителей пораженного ребенка были обнаружены патогенные мутантные локусы в одном и том же гене. Три из мутантных локусов, выявленных в обеих семьях (c.C427T для TGM1, c.G1463A и c. C1642T для ALOX12B), были ранее зарегистрированы в случаях ARCI. Несообщаемый сайт мутации (c.1106delG в TGM1) представляет собой мутацию сдвига, которая вызывает усеченный белок, что может привести к значительному укорочению или изменению структуры кодируемого белка и не наблюдается у 200 нормальных людей той же расы, что делает ее высоковероятной в качестве патогенного сайта мутации. Поскольку обе пары являются носителями патогенного гена, вероятность второй беременности с ХБ составляет 25%, и мы рекомендуем проводить пренатальную диагностику во время беременности.
Пренатальная диагностика может быть проведена путем аспирации ворсин хориона на 9-11 неделе беременности или путем амниоцентеза на 16-20 неделе беременности для хромосомного анализа или анализа ДНК. Преимущество аспирации ворсин хориона заключается в том, что она обеспечивает раннее выявление заболевания плода, тем самым уменьшая ненужную боль и дистресс для матери, но это несколько сложнее и рискованнее, чем амниоцентез, и культура клеток ворсин хориона сложна, что затрудняет последующую проверку при подозрении на загрязнение материнской крови или материнских тканей. Культура клеток амниотической жидкости, с другой стороны, относительно проста в исполнении, и исключить заражение материнской кровью на более поздней стадии легче. Две семьи выбрали разные методы забора образцов плода в зависимости от обстоятельств. Наши результаты пренатальной диагностики были точными в обоих случаях.
Хотя это исследование в конечном итоге увенчалось успехом в постановке пренатального диагноза для обеих семей, выявление заболевания на основе методов секвенирования первого поколения (секвенирование по Сэнгеру) потребовало бы много времени, труда и затрат, учитывая большое количество кандидатных патогенных генов. В последние годы стоимость секвенирования второго поколения на основе массивно-параллельного секвенирования ДНК снижается [9, 10], а концентрация большого количества генов-кандидатов в одной реакционной системе или микрочипе для захвата и высокопроизводительного секвенирования позволит значительно снизить человеческие и материальные затраты и ускорить обнаружение. В будущем он, вероятно, заменит секвенирование первого поколения для клинических и лабораторных исследований. В сотрудничестве с Институтом генетики Хуаканга наша лаборатория разработала систему захвата, содержащую кодирующие последовательности всех зарегистрированных патогенных генов наследственного ихтиоза для секвенирования второго поколения, и в настоящее время проверяет ее чувствительность и специфичность.
Рисунок 1 Секвенирование родителей пациента. 1a показывает гетерозиготные мутации c.C427T и c.1106delG в гене TGM1 у родителей семьи 1; 1b показывает гетерозиготные мутации c.G1463A и c.C1642T в гене ALOX12B у родителей семьи 2, соответственно.