Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) — это анализ генетического материала гамет или эмбрионов до имплантации эмбриона и отбор эмбрионов без генетических отклонений для переноса. Преимплантационный генетический скрининг (ПГС) — это отбор хромосомно интактных эмбрионов для переноса, что повышает процент успеха ЭКО-ЭТ. Первый в мире ребенок ПГД родился в 1990 году, к 2004 году родилось более 1 000 нормальных детей с ПГД-диагнозом, а к 2010 году в мире родится около 10 000 детей ПГД и ПГС.
1. Показания к проведению ПГД и ПГС
(1) Показания для проведения ПГД
Моногенные и сцепленные с полом генетические расстройства: Первый в мире диагноз ПГД был поставлен при Х-сцепленном рецессивном генетическом расстройстве, и Хэндисайд и др. смогли отобрать женские эмбрионы для переноса путем тестирования пола эмбрионов, что привело к успешной беременности. С тех пор с помощью ПГД было диагностировано множество генетических заболеваний, таких как муковисцидоз, талассемия, спинальная мышечная атрофия, болезнь Хантингтона и т.д. В 1999 году в Первой больнице Университета Сунь Ятсена был зарегистрирован первый случай ПГД в материковом Китае. ПГД при моногенных генетических заболеваниях включает генетическое определение гена, вызывающего заболевание, и отбор эмбрионов, свободных от генетических мутаций, для пересадки, чтобы избежать заболевания у потомства, а при сцепленных с полом генетических заболеваниях это также В случае сцепленных с полом генетических нарушений возможность избежать заболеваемости потомства также может быть достигнута путем определения пола эмбриона. Однако в случае Х-сцепленных рецессивных заболеваний, если для переноса отбираются мужские эмбрионы, хотя у потомства не будет развиваться заболевание, теоретически 50% мужских нормальных эмбрионов будут отбракованы, а 50% женских эмбрионов-носителей будут сохранены.
(2) Хромосомные нарушения: хромосомные нарушения можно разделить на числовые и структурные: например, 47,XXX (болезнь Крона) и синдром Тернера (45,XO) являются числовыми нарушениями, а реципрокные транслокации, транслокации Робертсона и инверсии хромосом — структурными нарушениями. Реципрокные транслокации происходят, когда две хромосомы разрываются, а затем вновь соединяются друг с другом после обмена без разрывов хромосом, с частотой встречаемости около 1/6 x 106 в популяции. Также известные как сбалансированные транслокации, они обычно нормальны по интеллекту и фенотипу, но могут привести к снижению фертильности, повторяющимся выкидышам и порокам развития детей при рождении из-за производства несбалансированных гамет. С помощью ПГД отбор нормальных или сбалансированных эмбрионов для переноса может решить проблемы фертильности этой группы.
Методы флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) используются в области ПГД для выявления хромосомных нарушений уже более десяти лет. Хотя количество диагностируемых хромосомных полос очень ограничено из-за необходимости подбора зондов и разработки экспериментальных протоколов в соответствии с различными хромосомными нарушениями, FISH прост в проведении и решил проблемы фертильности для многих пар с хромосомными нарушениями. В последние годы, с развитием методов молекулярной биологии, все больше и больше ПГД при хромосомных нарушениях используют генные чипы или методы секвенирования второго поколения. Эти новые методы могут обнаружить не только проблемные хромосомы, но и все остальные хромосомы, предоставляя больше генетической информации.
(3) Подбор антигена лейкоцитов человека (HLA): для некоторых семей, имеющих детей с заболеваниями крови, ПГД позволяет пересадить эмбрион с тем же типом HLA-отбора, что и у больного ребенка, чтобы спасти уже имеющегося ребенка с заболеванием крови. Однако ребенок ПГД рождается, потому что это «ребенок, спасающий жизнь», в то время как другие эмбрионы выбрасываются, потому что у них нет «функции, спасающей жизнь», что является этически спорным.
(4) Митохондриальная болезнь: Приблизительно 15% заболеваний митохондрий или окислительного фосфорилирования вызваны унаследованными по материнской линии мутациями митохондриальной ДНК (мтДНК). Поэтому риск заболевания у потомства может быть снижен путем отбора эмбрионов с частотой мутаций мтДНК ниже порога патогенеза с помощью ПГД.
Показания к ПГС: ПГС — это метод скрининга эмбрионов, направленный на улучшение показателей беременности и живорождения. Впервые о ПГС было сообщено Мунне и др. в 1993 году, и с тех пор с каждым годом она используется все шире, а в 2009 году Европейское общество репродукции человека и эмбриологии (ESHRE) PGD Collaboration сообщило о 3551 цикле ПГС.
Основными показаниями для проведения ПГС являются необъяснимые повторяющиеся нарушения фертильности, необъяснимые повторяющиеся выкидыши и пожилой возраст женщины. Хотя использование PGS все еще вызывает споры, большинство ученых выступают за отказ от FISH для PGS, а многие исследования показали, что PGS может повысить частоту оплодотворения, снизить частоту спонтанных абортов, уменьшить количество анеуплоидных беременностей и повысить успешность вспомогательных репродуктивных технологий; однако необходимо дальнейшее подтверждение в многоцентровых исследованиях с большими выборками.
2. преимплантационная диагностика и отбор скрининговых проб
Сбор материала является важным этапом в ПГД и ПГС, не только для того, чтобы обеспечить пригодность полученных клеток для генетической диагностики, но и для того, чтобы минимизировать влияние сбора материала на развитие эмбриона.
Источники материала для PGD
(1) Полярные тела: Полярные тела являются побочным продуктом ооцита и оказывают незначительное влияние на эмбриональное развитие. Полярное тело может обеспечить относительно длительную генетическую диагностику, облегчая перенос эмбрионов в свежих циклах. Однако использование полярных тел позволяет получить генетическую информацию только от матери.
(2) Шизонты: Одноклеточный генетический анализ с использованием шизонтов из оогенных эмбрионов позволяет одновременно анализировать генетическую информацию от обоих родителей и был преобладающим источником выборки в предыдущие годы работы ПГД. Однако в связи с ограниченной доступностью клеток для диагностики и высокой долей химерных оогенных эмбрионов, доля отбора проб с расщепленным шаром в настоящее время снижается.
(3) Извлечение бластоцисты: доля химеризма на стадии бластоцисты значительно ниже, чем при оогенезе, и извлечение трофэктодермы из бластоцисты не только увеличивает количество полученных клеток и повышает точность генетической диагностики, но и наносит относительно небольшой ущерб эмбриону. Конечно, все более совершенные методы культивирования бластоцист, методы витрификации и замораживания-размораживания, а также развитие лазерных инструментов также обеспечили технологию для широкого использования отбора проб бластоцист.
Методы извлечения ПГД
Извлечение эмбриона является важным этапом процесса ПГД, и его успех напрямую влияет на окончательный диагноз ПГД, а также является инвазивной процедурой для эмбриона. Процесс извлечения состоит из двух процессов: перфорация zona pellucida и сбор клеток. Перфорация прозрачной полосы включает химический, механический и лазерный методы. Химический метод используется редко из-за потенциального повреждения эмбриона кислотой Тирода; механический метод, хотя и относительно менее вреден для эмбриона, технически сложен и требует много времени для проведения in vitro, и постепенно заменяется лазерным методом.
Лазерный метод перфорации zona pellucida означает, что лазерная энергия, генерируемая лазерным генератором, вызывает плавление и испарение локальной zona pellucida, а размер перфорации zona pellucida можно контролировать путем регулировки лазерной энергии, времени воздействия и количества импульсов.
3. Технология генетической диагностики
(1) Применение технологии ПЦР в ПГД: полимеразная цепная реакция (ПЦР) использует пару олигонуклеотидных нитей в качестве праймеров для направления ДНК-полимеразы на синтез ДНК на двух комплементарных нитях между сайтами распознавания праймеров, и после трех этапов денатурации шаблона, отжига и удлинения в течение одного цикла, продукт каждого цикла может быть использован в качестве шаблона для следующего цикла. Продукт каждого цикла может быть использован в качестве шаблона для следующего цикла. Первый в мире случай ПГД был осуществлен методом ПЦР.
Поскольку диагностический материал для ПГД и ПГС представляет собой одну или несколько клеток с минимальным содержанием ДНК, он подвержен сбоям амплификации или смещению амплификации, что серьезно ограничивает развитие ПГД и ПГС. Хотя многие ученые разработали методы, основанные на ПЦР, такие как гнездовая ПЦР, мультиплексная ПЦР и флуоресцентная количественная ПЦР, которые в определенной степени расширили сферу применения диагностики ПГД, они все еще очень ограничены.
В последние годы быстро развивается цельногеномная амплификация (ЦГА) — метод неселективной амплификации всей геномной последовательности с целью существенного увеличения общего количества ДНК без предрасположенности к последовательности — и занимает лидирующие позиции в области ПГД и ПГС. Некоторые из наиболее популярных методов ВГА, используемых в ПГД и ПГС: ПЦР с олигонуклеотидным праймером De Minimis (DOP-PCR), ПЦР с реакцией расширения праймера перед амплификацией (PEP-PCR), амплификация со смещением прядей (MDA) и амплификация с множественными отжигами (MALBAC).
Использование продуктов WGA для обнаружения генных чипов или секвенирования второго поколения в настоящее время является наиболее широко используемым методом в области ПГД и ПГС и будет более подробно описано ниже. Методы одноклеточной ПЦР не только требовательны к лаборатории, но и сопряжены с такими проблемами, как сбой амплификации, загрязнение и аллельная декапирование.
(2) Применение метода FISH в ПГД и ПГС: FISH — это метод диагностики, при котором специфический ДНК-зонд, меченный флуорохромом, гибридизируется in situ с определенной хромосомной последовательностью, измеряемой в клетках ткани при определенных условиях, а сигнал гибридизации отображается и наблюдается под флуоресцентным микроскопом. fISH в основном используется в ПГД для диагностики сцепленных с полом заболеваний и хромосомных нарушений. Хотя FISH относительно прост в исполнении и не требует амплификации ДНК, количество хромосом, которые могут быть обнаружены с помощью FISH, ограничено (до 10-12), различные зонды должны быть выбраны в соответствии с хромосомами, которые должны быть обнаружены, и оценка сигнала иногда затруднена. В последние годы технология FISH была заменена технологией генного чипа и технологией секвенирования следующего поколения (NGS).
(3) Применение технологии генного микрочипа в ПГД и ПГС: Технология генного микрочипа позволяет одновременно выявлять полиморфизмы или мутации в тысячах известных генов. В настоящее время основные клинические применения генных микрочипов включают сравнительную геномную гибридизацию (CGH) и однонуклеотидный полиморфизм (SNP). Методы CGH и SNP могут выявить более тонкие хромосомные изменения, такие как повторы и делеции >3 Мп.
могут быть обнаружены. Сочетание одноклеточной амплификации всего генома и технологии микрочипов позволяет выявлять хромосомные состояния в одноклеточных или микроскопических клетках. Поэтому микрочипы CGH и SNP широко используются в области PGS и PGD хромосомных нарушений.
(4) Применение технологии NGS в ПГД и ПГС: NGS родственна традиционному секвенированию по Сэнгеру, которое изменило процесс секвенирования в масштабе и характеризуется тем, что вместо выделения одного шаблона, шаблон превращается в «библиотеку», включающую все шаблоны, которые необходимо секвенировать, опять же на основе шаблона Последовательности синтезируются или гибридизируются для формирования комплементарных нитей, и каждое основание идентифицируется флуоресцентным маркером, вводимым во время удлинения комплементарной нити. С 2008 года стоимость секвенирования всего генома экспоненциально падает, и это стало важным условием для того, чтобы NGS начали использоваться в клинической практике ПГД и ПГС.
Когда речь идет о NGS, необходимо также упомянуть важный термин: глубина секвенирования. Глубина секвенирования — это отношение общего количества секвенированных оснований (bp) к размеру генома, который обычно понимается как количество раз, когда геном был секвенирован, и является одной из метрик, используемых для оценки объема секвенирования. Существует положительная корреляция между глубиной секвенирования и покрытием генома, при этом частота ошибок или ложноположительных результатов секвенирования уменьшается по мере увеличения глубины секвенирования.
Существует также 2 типа НГС для ПГД и ПГС: в одном случае отобранные клетки сначала подвергаются РГА, а затем НГС, что является более распространенным подходом. В другом случае отобранные эмбриональные клетки не подвергаются РГА, а вместо этого большое количество специфических фрагментов амплифицируется с помощью миметических методов ПЦР, и эти амплифицированные фрагменты затем подвергаются NGS.
На ежегодном собрании ESHRE в 2013 году Уэллс и др. сообщили об успешной беременности с использованием NGS-PGS; в том же году компания UW-Gene и больница Сянъя также сообщили об успешном случае PGS с использованием бластоцист, обнаруженных с помощью NGS. В 2013 году Трефф и др. провели ПГД у шести пар (две с муковисцидозом и по одной с синдромом Уокера-Варбурга, семейной вегетативной дисфункцией, Х-сцепленной гипофосфатазией рахита и нейрофибромой). Для диагностики ПГД в других лабораториях использовались методы генетической диагностики, qPCR и NGS, соответственно. В 2014 году в репродуктивном центре больницы Пекинского университета родились первый и второй в мире дети, прошедшие ПГД с амплификацией MALBAC, с диагнозами наследственная множественная остеохондрома и Х-сцепленная гипогидротическая эктодермальная дисплазия, соответственно.
Использование технологии NGS в области ПГД и ПГС постепенно развивается, и самым большим преимуществом технологии NGS является также то, что она может выявлять не только анеуплоидию у эмбрионов, но и моногенные заболевания. Это то, чего пока не могут достичь другие технологии.
4. этические соображения
Хотя ПГД и ПГС позволяют избежать абортов или искусственных прерываний беременности, связанных с обычной пренатальной диагностикой, остается еще много вопросов, требующих внимания при практическом клиническом применении этой технологии. ПГД и ПГС используются для получения окончательного диагноза путем инвазивных манипуляций с эмбрионом и требуют длительного наблюдения за большой выборкой потомства. Кроме того, существует множество противоречий, связанных с отказом от эмбрионов во время ПГД. Например, при половом скрининге на Х-сцепленные рецессивные заболевания половина здоровых мужских эмбрионов отбраковывается, а половина женских эмбрионов-носителей сохраняется, в то время как при аутосомно-рецессивных заболеваниях возникают разногласия по поводу того, переносить ли гетерозиготные эмбрионы.
Некоторые показания к ПГД также вызывают споры, например, анализ предрасположенности к некоторым семейным опухолям (например, семейный полипоз толстой кишки, рак молочной железы и т.д.), подбор HLA для спасения детей с уже существующими заболеваниями крови и т.д.
Важно отметить важность генетического консультирования перед проведением ПГД. Анализ данных, собранных ESHRE по ПГД в 2009 году, показал, что средний уровень беременности при ПГД составил всего 23,04%. Поэтому врачам следует быть более благосклонными к своим пациентам, объективно рассказывая о процессе ПГД и его результатах, а не преувеличивая его успешный исход. Пары должны быть четко проинформированы о возможности ошибочного диагноза ПГД, а также должны быть рекомендованы для прохождения дальнейшей плановой дородовой диагностики в случае беременности; диагностика ПГД не должна заканчиваться переносом эмбриона в организм матери, а должна продолжаться вплоть до дородовой диагностики и даже до последующего рождения ребенка. Последующее наблюдение за этими детьми также значительно повысит удовлетворенность пациентов.
В целом, методы одноклеточной генетической диагностики быстро меняются, что ведет к быстрому развитию области ПГД и ПГС. Если рождение Луиса Брауна в 1978 году стало вехой в области вспомогательной репродукции человека, то стремительное развитие одноклеточной генетической диагностики принесло новую надежду многим парам с высоким риском генетических заболеваний. В последние годы в Европе и США были разработаны технические руководства или рекомендации по ПГД и ПГС, а Комиссия по здравоохранению и планированию семьи Китая выпустила Уведомление об экспериментальном клиническом применении высокопроизводительного генетического секвенирования для преимплантационной генетической диагностики эмбрионов в институтах вспомогательной репродукции, и соответствующие органы также начали разрабатывать подробные технические спецификации. С постоянным развитием и совершенствованием технологии одноклеточной генетической диагностики считается, что все больше пар с высоким риском генетических заболеваний смогут извлечь из нее пользу.