Опухоли мочевого пузыря имеют биологическую особенность легко рецидивировать, и послеоперационное лечение с помощью внутрипузырной инстилляции лекарственных препаратов может значительно улучшить прогноз. Однако при проведении химиотерапии остается много проблем, среди которых одним из важных факторов неудачи химиотерапии является множественная лекарственная устойчивость (МЛУ), поэтому в последние годы МЛУ стала актуальной темой клинических и фундаментальных исследований в онкологии. Причиной МЛУ могут быть различные факторы, среди которых наиболее широко изучен механизм Р-гликопротеина, на экспрессию которого влияют различные факторы. В данном эксперименте изучается экспрессия гена множественной лекарственной устойчивости (MDR-1мРНК) на уровне генов и ее влияние на клинико-биологическое поведение. 1, Данные и методы 1.1 Объекты исследования Все образцы были взяты из тканей хирургически резецированных опухолей мочевого пузыря пациентов, госпитализированных в данное отделение в период с января 1998 по декабрь 1998 года, которые были обнаружены при цистоскопии до операции и подтверждены при патологоанатомическом исследовании. Патологический тип: все 30 случаев в этой группе представляли собой мигрирующую клеточную карциному мочевого пузыря, в соответствии с классификацией ВОЗ по патологическим тканям: G110 случаев, G213 случаев, G37 случаев. В 16 случаях наблюдались первичные опухоли, а в 14 случаях — рецидивы после внутрипузырной инстилляции химиотерапевтических препаратов. Нормальным контролем служила нормальная слизистая оболочка мочевого пузыря на расстоянии более 2 см от основания опухоли мочевого пузыря, которую интраоперационно резецировали и гистологически исследовали как нормальную. 1.2 Сбор и хранение образцов тканей Все образцы собирались при удалении опухоли мочевого пузыря во время операции, при этом при заборе образцов избегалась некротическая ткань в центре опухоли. Для экспериментов использовались свежие образцы в течение 2 ч после операции, либо образцы помещались в сверхнизкотемпературный холодильник при -70 ℃ сразу после их удаления для сохранения до исследования. 1.3 Основные реактивы: обратная транскриптаза AMV была приобретена у компании Promega, а TaqDNA-полимераза — у Института генетики Китайской академии наук. 1.4 Основные инструменты ПЦР-прибор Gene Cycler (B10-RAD, США). 1.5 Определение уровня экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости (MDR1) Использовали количественную RT-PCR. 1.5.1 Выделение тканевой тотальной РНК: выделение тотальной РНК в образцах проводили одностадийным методом изотиоциановой кислоты, экстрагированную тотальную РНК растворяли в 50-100 мкл деионизированной воды DEPC, затем отбирали часть образцов для определения их качества методом формальдегидного гель-электрофореза, определяли A260 и A280 методом УФ-спектрофотометрии, рассчитывали A260/A280, соотношение было больше 1,8, и содержание РНК рассчитывали по A260. Соотношение A260/A280 было больше 1,8, и содержание РНК рассчитывалось по A260. 1.5.2 Синтез кДНК методом обратной транскрипции Реакцию обратной транскрипции проводили в реакционной системе объемом 50 мкл, содержащей 5 мкл общей РНК, 0,5 мкг ингибитора РНКазы (Rnasin 40 U, AMV 10 U, dNTP 40 мкл) и 0,5 мкг ингибитора РНКазы (Rnasin 40 U, AMV 10 U, dNTP 40 мкл.) 40 мкл). RT завершали на водяной бане при температуре 42 ℃ в течение 1 ч. Фермент инактивировали на водяной бане при температуре 95 ℃ в течение 5 мин и сразу же помещали в ледяную баню, добавляли 50 мкл DEPC для приготовления шаблона кДНК, используемого для ПЦР. 1.5.3 Реакция амплификации ПЦР: Реакцию амплификации ПЦР проводили с использованием двух пар олигонуклеотидных праймеров, одна из которых представляла собой праймер MDR-1mRNAcDNA, последовательность праймеров: справедливость MDR-1mRNA: 5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3′; антисмысл: 5′-GTTCAAACTTCTGCTCCTCA-3′. Праймер внутреннего контроля β2-микроглобулина был разработан с учетом литературных данных: 5′-ACCCCCCACTGAAAAAGATGA3′-ATCTTCAAACCTCCATGATG. 1.5.4 Суждение о результатах ПЦР: после разделения продуктов ПЦР с помощью электрофореза положительный образец должен иметь три полосы с молекулярной массой 300 п.о. и 170 п.о., соответственно, где 300 п.о. — это внутренний стандарт b2-МГ, а продукт длиной 170 п.н. представляет собой ген мРНК MDR-1. Отношение интенсивностей двух полос (MDR-1mRNA/b2MG) является относительной величиной экспрессии гена MDR-1mRNA, по которой можно судить о различиях в степени экспрессии MDR-1mRNA в каждом образце. 2. Результаты Описанные выше условия RT-PCR были применены к 30 образцам опухолей мочевого пузыря и 26 нормальным тканям слизистой мочевого пузыря, экспрессия MDR-1мРНК в 26 нормальных образцах слизистой мочевого пузыря составила 15,4%. 17/30 (56,7%) из 30 опухолей мочевого пузыря были положительными для MDR-1мРНК, а уровень позитивности опухолей G1, G2 и G3 составил 40%, 61,5%, 61,5%, 61,5% и 61,5%, соответственно. Частота позитивности опухолей G1, G2 и G3 составила 40%, 61,5% и 71,4% соответственно. 16 образцов первичной опухоли имели частоту позитивности 37,5%, а 14 образцов рецидивной опухоли после химиотерапии — 78,6%. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в нормальной ткани слизистой оболочки мочевого пузыря имеется экспрессия MDR-1мРНК, причем экспрессия MDR-1мРНК связана со степенью дифференцировки опухоли. В рецидивных опухолях после химиотерапии наблюдалось значительное усиление экспрессии MDR-1мРНК. 3, ОБСУЖДЕНИЕ Резистентность опухолевых клеток мочевого пузыря к химиотерапевтическим препаратам является основным препятствием для проведения послеоперационной химиотерапии опухолей мочевого пузыря. Основной причиной, по которой многие опухоли в клинике неизбежно рецидивируют после первоначально эффективной химиотерапии, является резистентность опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам. К широко используемым химиотерапевтическим препаратам, связанным с геном MDR1, относятся алкилирующие агенты (например, BCNU, ME-CCNU и др.), растительные основания (например, Vincristine, Vincristine, VM26 и др.), антибиотики (например, mitomycin, Adriamycin, Bleomycin и др.), гормоны (например, dexamethasone и др.). Эти препараты, как правило, представляют собой липофильные соединения с большой молекулярной массой и широко используются в терапии опухолей мочевого пузыря. При устойчивости опухолевых клеток к одному из этих препаратов они могут одновременно проявлять перекрестную толерантность к другим типам лекарств, поэтому экспрессия гена MDR1 в опухолях мочевого пузыря тесно связана с устойчивостью к химиотерапевтическим препаратам.