CIK (cytokine-induced killer, китайское название: [autologous cell immunotherapy] multiple cytokine-induced killer cells) — это гетерогенная группа клеток, полученных путем совместного культивирования мононуклеарных клеток периферической крови человека с несколькими цитокинами (например, анти-CD3 моноклональным антителом, IL-2 и IFN-γ) in vitro в течение определенного периода времени. Поскольку эти клетки экспрессируют как CD3+, так и CD56+ молекулы мембранного белка, они также известны как NK-клеточно-подобные Т-лимфоциты, которые обладают как мощной противоопухолевой активностью Т-лимфоцитов, так и преимуществом NK-клеток по уничтожению опухолей без ограничения по MHC. Поэтому использование CIK-клеток считается предпочтительным вариантом для следующего поколения противоопухолевой клеточной иммунотерапии. Эффекторные CD3+ и CD56+ клетки в CIK-клетках чрезвычайно редки в нормальной периферической крови человека и составляют всего 1%-5%. CD3+CD56+ клетки быстро увеличивались in vitro в течение 28-30 дней после многофакторного культивирования, причем увеличение было более чем в 1000 раз по сравнению с таковым до культивирования. Было показано, что увеличенные CD3+CD56+ клетки были получены из CD3+CD56-T клеток, а не из CD3-CD56+ NK клеток. Также было установлено, что среди CD3+CD56- Т-клеток все три подмножества Т-клеток (CD4-CD8+, CD4-CD8- и CD4+CD8+) могут получить экспрессию молекул CD56 через многофакторную культуру in vitro, а поскольку уровни CD4+CD8+ клеток и CD4-CD8- клеток в нормальной периферической крови человека. Косвенно, CD3+CD56+ клетки в основном были получены из CD4-CD8+ Т-клеток в периферической крови из-за крайне низкого уровня CD4+CD8+ клеток и CD4-CD8-клеток в нормальной периферической крови человека. Поскольку почти 56% CD4-CD8-T-клеток экспрессируют CD56 и CD3 после 1 месяца культуры, они также являются важным источником CIK-клеток. При сравнении CD3+CD56+ CIK клеток с CD8+ и CD8-, не было обнаружено существенной разницы в их опухолевой киллинговой активности, что говорит о том, что цитотоксичность CIK клеток коррелирует с экспрессией CD3CD56, но не с экспрессией CD8. Принцип киллинга Клетки CIK способны убивать опухолевые клетки и клетки, инфицированные вирусами, по трем путям: ① Прямой киллинг опухолевых клеток и клеток, инфицированных вирусами, клетками CIK: клетки CIK могут распознавать опухолевые клетки через различные механизмы и высвобождать токсичные частицы, такие как гранзим/перфорин, что приводит к лизису опухолевых клеток. (ii) Большое количество воспалительных цитокинов, выделяемых клетками CIK, обладают опухолеубивающей активностью: клетки CIK, культивируемые in vitro, могут выделять различные цитокины, такие как IFN-γ, TNF-α и IL-2, которые не только оказывают прямое ингибирующее действие на опухолевые клетки, но и убивают опухолевые клетки косвенно, регулируя реактивность иммунной системы организма. ③CIK-клетки могут вызывать апоптоз опухолевых клеток: CIK-клетки, экспрессирующие FasL (трансмембранный гликопротеин II типа) в культуре, вызывают апоптоз опухолевых клеток путем связывания с Fas (трансмембранный гликопротеин I типа), экспрессированным в мембране опухолевых клеток. Три способа действия клеток CIK для уничтожения опухолей Характеристика применения Клетки LAK в настоящее время являются более популярной схемой иммунотерапии опухолей и широко используются при меланоме, почечно-клеточной карциноме, неходжкинской лимфоме, раке легких и раке толстой кишки. LAK-клетки имеют ограниченное число экспансий и более низкую активность уничтожения опухолей, чем TIL и другие Т-лимфоциты, поэтому, хотя они обладают широким спектром уничтожения опухолей, их эффект ограничен. Напротив, TIL-клетки сами по себе обладают более мощной противоопухолевой активностью, чем LAK-клетки, но их клиническое применение ограничено их узким спектром уничтожения опухолей, сложностью подготовки и функциональными изменениями, которые могут возникнуть в процессе сбора. Клетки CIK обладают уникальными преимуществами по сравнению с двумя вышеуказанными типами эффекторных клеток, которые перечислены ниже. 1, быстрая скорость пролиферации Клетки CIK в процессе культуры после добавления IFN-γ, IL-1α, анти-CD3, McAb, IL-2 и других мультифакторов, скорость пролиферации клеток быстро ускоряется, намного больше, чем у клеток LAK. На 22-й день культуры кривая пролиферации достигла пика, увеличившись в 100 раз, при этом абсолютное количество CD3+CD56+ клеток не только увеличилось более чем в 1000 раз, но и значительно увеличился процент клеток. 2, высокая активность уничтожения опухолей Клетки CIK представляют собой гетерогенную популяцию CD3+CD56+ Т-клеток, и многочисленные эксперименты in vivo и ex vivo подтвердили, что клетки CIK обладают более мощной активностью уничтожения опухолей, чем клетки LAK, которые в основном являются NK-клетками, и что поддержание их цитотоксичности уничтожения опухолей in vivo не зависит от постоянного введения больших доз экзогенного IL-2. В экспериментах in vitro Рен Хуан и Лу и др. обнаружили, что равное количество CIK-клеток обладает несколько большей или сходной киллинговой способностью, чем LAK-клетки, против линий опухолевых клеток in vitro, но общее количество киллинговых единиц (TLU) CIK-клеток в 73 раза или более превышало таковое LAK-клеток из-за быстрого роста CD3+CD56+ эффекторных клеток в культуре, а киллинговая эффективность CIK-клеток была значительно выше, чем у LAK-клеток. Анализ ингибирования опухолевых клоногенных клеток показал, что Log-индекс ингибирования опухолевых клеток у клеток CIK составлял 2,5-3,5, что на 2 Log выше, чем у клеток LAK. Эффект клеток CIK был значительно лучше, чем у клеток LAK, в очистке опухолевых очагов, подавлении метастазирования и продлении выживания. Хотя CIK-клетки используют CD3+CD56+ Т-клетки в качестве основных эффекторных клеток, у них нет MHC-ограничения киллинга Т-лимфоцитов, поэтому они более эффективны против различных линий опухолевых клеток (включая NK-чувствительные K562 и NK-нечувствительные Hela, HL60, линию клеток острого Т-клеточного лимфобластного лейкоза человека OCRF-CEM, линии клеток лимфомы человека OCI-LY8 и LAM53 и линию клеток рака толстой кишки человека OCRF-CEM). LAM53, клеточные линии рака толстой кишки человека HT-29, CR75, клеточная линия рака почки человека A704) и свежая опухолевая ткань показали мощную убивающую активность. 4. Одинаково чувствительны к мультирезистентным опухолевым клеткам Вольф индуцировал мультирезистентные клеточные линии K562/DOX и CCRF-CEM-VBL адриамицином и винкристином и обнаружил, что клетки CIK проявляют мощную киллинговую активность как против чувствительных к химиотерапии родительских клеток, так и против нечувствительных трансформированных клеток, без различий между ними. 5. На киллинговую активность опухоли не влияли иммунодепрессанты, такие как CsA и FK506 Мехта заметил, что хотя иммунодепрессанты CsA и FK506 могли ингибировать процесс дегрануляции клеток CIK, опосредованный анти-CD3 моноклональным антителом, они не влияли на дегрануляцию клеток CIK, вызванную клетками-мишенями, и в результате киллинговая активность клеток CIK против клеток-мишеней не снижалась. 6. влияние CIK-клеток на гемопоэтические клетки-предшественники костного мозга было исследовано с помощью анализа образования CFU-GM, проведенного Seheffold, который обнаружил, что CIK-клетки убивали клетки K562 с интенсивностью 3 класса, но ингибировали GM-CFU менее чем на 1 класс. Холие также продемонстрировал, что CIK-клетки слабо влияли на нормальный миелоидный клоногенез и демонстрировали лишь слабое ингибирование продукции красной линии, что может быть связано с более высоким уровнем IFN-γ, секретируемого самими CIK-клетками. 7. способность противостоять Fas-FasL апоптозу эффекторных клеток, запускаемому опухолевыми клетками, как было показано, важной причиной неудачи вторичной иммунотерапии является индукция апоптоза вторичных эффекторных клеток определенными белками (в основном FasL), экспрессированными на поверхности опухолевых клеток, в то время как клетки CIK не оказывают существенного влияния на их опухолевую киллинговую цитотоксичность, хотя и вызывают небольшое количество апоптоза после захвата Fas. экспериментов предположил экспрессию антиапоптотических генов в CIK-клетках и обнаружил ап-регуляцию уровней транскриптов различных защитных генов, таких как cFLIP, Bcl-2, Bcl-X1, DAD1 и survivin. Также было обнаружено, что клетки CIK обладают способностью синтезировать FasL, а биологически активный водорастворимый FasL был обнаружен в супернатанте культур клеток CIK, что указывает на то, что клетки CIK могут противодействовать снижению или даже потере активности эффекторных клеток, вызванной FasL-положительными опухолями in vivo. Факторы, влияющие на киллинговую активность1, добавление экзогенных цитокиновДля экспансии клеток CIK in vitro требуется помощь экзогенных цитокинов, таких как IL-2, IL-7 и IL-12, которые контролируют экспансию и биологическую активность различных антиген-специфических клеток в иммунной системе человека. Экзогенные IL-2, IL-7 и IL-12 могут значительно стимулировать рост лимфоцитов, особенно в присутствии IL-2 и IL-7, в то время как экзогенные IL-2, IL-7 и IL-12 не влияют на цитотоксическую активность клеток CIK. Стимуляция экзогенными IL-2 и IL-7 снижала экспрессию соответствующих рецепторов на поверхности клеток CIK, тогда как молекулы CD28 были более высоко экспрессированы в присутствии IL-7, чем в присутствии IL-2. IL-12 снижал экспрессию ICAM-1 на поверхности клеток CIK, тогда как IL-7 увеличивал экспрессию CD56. ИЛ-7 значительно увеличивал долю CD4+ клеток по сравнению с ИЛ-2. Хотя небольшое количество апоптотических клеток может возникать при культивировании экзогенными IL-2, IL-7 и IL-12, некоторые исследования показали, что добавление экзогенного IL-12 увеличивает долю некротических клеток в клетках CIK. Лефтерова преинкубация анти-CD3McAb с клетками-мишенями увеличивала восприимчивость клеток CIK к киллингу, и это усиление частично блокировалось антителами против FcR (например, анти-CD36, анти-CD32). анти-CD3McAb), что косвенно свидетельствует о том, что повышенная киллинговая активность, вызванная анти-CD3McAb, связана с FcR-опосредованным связыванием антител. 2. Трансфекция генов нескольких цитокинов Поскольку экспансия клеток CIK зависит от экзогенных цитокинов, перенос соответствующих генов в клетки CIK путем переноса генов не только уменьшает количество используемых экзогенных цитокинов, но и увеличивает противоопухолевую активность самих клеток CIK. IL-7: Используя модифицированную аденовирусную трансгенную систему, Фитке трансфицировал клетки CIK геном человеческого IL-7 и обнаружил, что трансфицированные клетки продуцируют высокие концентрации IL-7, до 1100 пг/106 клеток/24 ч. Синтетический IL-7 обладал значительной биологической активностью и способствовал пролиферации трансфицированных клеток CIK значительно больше, чем нетрансфицированных. Экспрессия экзогенного IL-7 также изменяла секрецию других цитокинов клетками CIK, в частности TNF-α, чего не наблюдалось при добавлении IL-7 к нетрансфицированным CIK in vitro. Хотя различные поверхностные антигены, связанные с активностью по уничтожению клеток, такие как ICAM-1, не были значительно изменены на поверхности трансфицированных клеток CIK по сравнению с нетрансфицированными клетками CIK, способность трансфицированных клеток CIK убивать различные линии опухолевых клеток, такие как рак почки, злокачественная меланома и рак толстой кишки, была значительно повышена по сравнению с нетрансфицированными клетками CIK. IL-2: Лу и др. обнаружили, что экспрессия молекул CD56 во время культивирования клеток CIK зависела от IL-2, но присутствие только IL-2 уменьшало величину фенотипических изменений в культивируемых клетках CIK. Хотя некоторые эксперименты показывают, что для лечения клеток CIK in vivo не требуется постоянное поступление IL-2 in vitro, результаты Zoll и др. показали, что IL-2 в культуре in vitro способствовал пролиферации и киллинговой функции клеток CIK. Шмидт-Вольф ввел рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена IL-2 человека, в клетки CIK для лечения метастатических солидных опухолей методом электропорации и обнаружил, что после трансфекции клетки секретировали высокий уровень IL-2 (330-1,800 пг/106 клеток/24 часа, в среднем 836 пг/106 клеток/24 часа). Хотя до и после трансфекции не наблюдалось значительных изменений в экспрессии различных мембранных белков на поверхности клеток CIK, скорость пролиферации и активность уничтожения клеток трансфецированных клеток CIK были выше, чем у нетрансфецированных клеток в анализе in vitro. Процесс подготовки Клетки CIK были получены путем забора периферической крови у пациентов, инкубировались при 37°C в течение 2 часов в 5% CO2 инкубаторе, отделялись с помощью высокоскоростной центрифуги, собирались в суспензию и культивировались in vitro (имитируя среду in vivo человека) с добавлением различных цитокинов, таких как моноклональное антитело CD3, IFN-R, IL-2 и т.д. Культуральную среду меняли каждые 2-3 дня и собирали на 7, 11, 13 и 15 дни. Клетки CIK были собраны на 7, 11, 13 и 15 дни, и CD3+ и CD56+ клетки быстро увеличились, до 1000 раз больше, чем до культуры. История разработкиВ 1985 году американские хирурги впервые обнаружили, что высокие дозы IL-2 in vitro могут культивировать лимфоциты в клетки с сильным опухолеубивающим эффектом, называемые LAK-клетками. Позже было обнаружено, что добавление в культуральную среду моноклонального антитела CD3 увеличивает опухолеубивающую активность этих клеток более чем в десять раз и увеличивает количество экспансий, которые были названы CD3AK. Эти клетки пролиферируют чаще и обладают более высокой вирулентностью, чем клетки LAK. Впервые о CIK-клетках сообщили Шмидт Вольф и др. в Стэнфордском университете в 1991 году. Информация о клиническом применении CIK-клеток в Китае и соответствующие правила и положения были опубликованы уже в 1996 году, и более 100 медицинских учреждений в Китае провели клиническое применение и исследования этой технологии лечения. В соответствии с прогрессом клинического применения клеточной терапии в Китае и за рубежом, 1 мая 2009 года Министерство здравоохранения издало и внедрило «Меры по клиническому управлению и применению медицинских технологий», в соответствии с которыми «технология аутоиммунной клеточной терапии» классифицируется как медицинская технология класса III. Показания к применению Клеточная терапия CIK является одной из форм вторичной клеточной иммунотерапии. Поскольку литический эффект клеток CIK не имеет ограничений по MHC, т.е. не ограничен типом опухолевой ткани, он может уничтожить любой тип опухоли, но наиболее эффективен при раковых заболеваниях с высокой экспрессией антигена, таких как миелоидный лейкоз, меланома, почечно-клеточная карцинома, метастатический рак почек и неходжкинская лимфома. Клеточная терапия CIK также эффективна при других видах рака, таких как рак легких, толстой кишки, молочной железы, печени, желудка, колоректальный рак и т.д. Клеточная терапия CIK подходит для пациентов с любой стадией рака, но хорошо работает для пациентов с опухолями на ранней стадии или с низкой опухолевой нагрузкой после операции и радиотерапии. Она важна для удаления небольших остаточных поражений у пациентов после операции, радиотерапии или трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, предотвращения распространения и рецидива раковых клеток, повышения собственного иммунитета пациента и снижения токсических реакций. Терапия CIK-клетками может улучшить качество жизни и продлить время выживания с опухолью для некоторых пациентов, которые не подходят для операции и не переносят радиотерапию и химиотерапию. Особенности 1. Клетки CIK быстро пролиферируют, и противоопухолевые активные клетки могут пролиферировать в большом количестве, и их клеточная активность также значительно усиливается. 2.Клетки CIK обладают механизмом распознавания опухоли и не оказывают токсического воздействия на нормальные клетки. 3.Широкий спектр уничтожения опухолей, могут быть использованы для лечения лейкемии, лимфомы, рака легких, рака желудка, рака кишечника и других опухолей, и одинаково чувствительны к опухолевым клеткам с множественной лекарственной устойчивостью. 4. Это типичная модель персонализированного биологического лечения. Инфузия таких клеток обратно в организм может также повысить иммунные возможности организма и произвести специфический антивирусный эффект, оказывая, таким образом, двойное воздействие на лечение опухолей. 5. поскольку клетки CIK являются активированными аутологичными клетками, их использование очень безопасно. Эффективные CIK-клетки подавляют рост опухолевых клеток непосредственно путем прямого убийства и секреции различных цитокинов, а также вызывают апоптоз опухолевых клеток, играя терапевтическую роль. Большинство клеток, выполняющих функцию киллинга, выполняют свою функцию сразу после переливания, с периодом полураспада от 2 недель до месяца. В состав перелитых клеток входят некоторые клетки памяти, которые могут сохраняться от нескольких лет до десятилетий и быстро активируются in vivo для уничтожения клеток-мишеней при встрече с соответствующими стимулами. Поэтому интервал между курсами терапии клетками CIK в принципе составляет один месяц, и рекомендуется провести три последовательных курса с интервалом в один месяц в первый раз, а затем по одному курсу каждые шесть месяцев.