CIK (cytokine-induced killer, китайское название: [autologous cell immunotherapy] multiple cytokine-induced killer cells) — это гетерогенная группа клеток, полученных путем совместного культивирования мононуклеарных клеток периферической крови человека с несколькими цитокинами (например, анти-CD3 моноклональным антителом, IL-2 и IFN-γ) in vitro в течение определенного периода времени. Поскольку эти клетки экспрессируют как CD3+, так и CD56+ молекулы мембранного белка, они также известны как NK-клеточно-подобные Т-лимфоциты, которые обладают как мощной противоопухолевой активностью Т-лимфоцитов, так и преимуществом NK-клеток по уничтожению опухолей без ограничения по MHC. Поэтому использование CIK-клеток считается предпочтительным вариантом для следующего поколения противоопухолевой перицитарной иммунотерапии. Эффекторные CD3+ и CD56+ клетки CIK-клеток крайне редко встречаются в нормальной периферической крови человека — всего 1-5%. [1] Характеристики CIK Эффекторные CD3+CD56+ клетки в клетках CIK чрезвычайно редки в нормальной периферической крови человека, всего 1-5%, а после 28-30 дней многофакторной культуры in vitro CD3+CD56+ клетки быстро увеличиваются, до 1000 раз больше, чем до культуры. Было продемонстрировано, что расширенные CD3+CD56+ клетки были получены из CD3+CD56-T клеток, а не из CD3-CD56+ NK клеток. Также было установлено, что среди CD3+CD56- Т-клеток все три подмножества Т-клеток (CD4-CD8+, CD4-CD8- и CD4+CD8+) могут получить экспрессию молекул CD56 через многофакторную культуру in vitro, и поскольку уровни CD4+CD8+ клеток и CD4-CD8- клеток в нормальной периферической крови человека. Об этом косвенно свидетельствует крайне низкий уровень CD3+CD56+ клеток в нормальной периферической крови человека, которые в основном образуются из CD4-CD8+ Т-клеток в периферической крови. Поскольку почти 56% CD4-CD8-T-клеток экспрессируют как CD56, так и CD3 после 1 месяца культуры, они также являются важным источником CIK-клеток. Сравнивая CD3+CD56+ CIK-клетки с CD8+ и CD8-, не было обнаружено существенной разницы в их опухолевой киллинговой активности, что говорит о том, что цитотоксичность CIK-клеток, как правило, коррелирует с экспрессией CD3CD56, но не с экспрессией CD8. Принцип киллинга Клетки CIK способны убивать опухолевые клетки и клетки, инфицированные вирусами, тремя способами: ① Прямой киллинг опухолевых клеток и клеток, инфицированных вирусами, клетками CIK: клетки CIK могут распознавать опухолевые клетки через различные механизмы и высвобождать токсичные частицы, такие как гранзим/перфорин, что приводит к лизису опухолевых клеток. (ii) Большое количество воспалительных цитокинов, выделяемых клетками CIK, обладают опухолеубивающей активностью: клетки CIK, культивируемые in vitro, могут выделять различные цитокины, такие как IFN-γ, TNF-α и IL-2, которые не только оказывают прямое ингибирующее действие на опухолевые клетки, но и убивают опухолевые клетки косвенно, регулируя реактивность иммунной системы организма. Клетки CIK могут вызывать апоптоз опухолевых клеток: клетки CIK, экспрессирующие FasL (трансмембранный гликопротеин II типа) в культуре, вызывают апоптоз опухолевых клеток путем связывания с Fas (трансмембранный гликопротеин I типа), экспрессированным в мембране опухолевых клеток. Три способа действия клеток CIK Убийственные характеристики опухоли Использование клеток LAK в настоящее время является популярным режимом иммунотерапии опухолей и широко применяется при меланоме, почечно-клеточной карциноме, неходжкинской лимфоме, раке легких и раке толстой кишки. LAK-клетки имеют ограниченное число экспансий и более низкую активность по уничтожению опухолей, чем TIL и другие Т-лимфоциты, поэтому, хотя они обладают широким спектром уничтожения опухолей, их действие ограничено. Напротив, TIL-клетки сами по себе обладают более мощной противоопухолевой активностью, чем LAK-клетки, но их клиническое применение ограничено их узким спектром уничтожения опухолей, сложностью подготовки и функциональными изменениями, которые могут произойти во время сбора. Клетки CIK обладают уникальными преимуществами по сравнению с двумя вышеперечисленными типами эффекторных клеток, которые перечислены ниже. 1. быстрая пролиферация Клетки CIK быстро пролиферируют после добавления IFN-γ, IL-1α, анти-CD3, McAb, IL-2 и других мультифакторов в культуре, значительно превышая показатели клеток LAK. Кривая пролиферации достигала пика на 22-й день культуры, с увеличением примерно в 100 раз. Абсолютное количество CD3+CD56+ клеток не только увеличивалось более чем в 1000 раз, но и значительно возрастал процент клеток. 2. Высокая опухолеубивающая активность CIK-клетки представляют собой гетерогенную популяцию CD3+CD56+ Т-клеток, и многочисленные эксперименты in vitro и in vivo показали, что CIK-клетки обладают более мощной опухолеубивающей активностью, чем LAK-клетки, которые в основном являются NK-клетками, и что поддержание ими опухолеубивающей цитотоксичности in vivo не зависит от постоянного введения больших доз экзогенного IL-2. В экспериментах in vitro Рен Хуан и Лу и др. обнаружили, что равное количество CIK-клеток обладает несколько большей или сходной киллинговой способностью, чем LAK-клетки против линий опухолевых клеток in vitro, но общая киллинговая единица (TLU) CIK-клеток была в 73 раза или более выше, чем у LAK-клеток, из-за быстрого роста CD3+CD56+ эффекторных клеток в культуре, а киллинговая эффективность CIK-клеток была значительно выше, чем у LAK-клеток. Эксперименты in vivo показали, что клетки CIK были значительно эффективнее клеток LAK в очистке опухолевых очагов, подавлении метастазирования и продлении выживания в модели В-клеточной лимфомы человека SU-DHL4, созданной на мышах с тяжелым комбинированным иммунодефицитом. Эффекты клеток CIK были значительно лучше, чем у клеток LAK, в очистке опухолевых очагов, подавлении метастазирования и продлении выживания. Хотя CIK-клетки используют CD3+CD56+ Т-клетки в качестве основных эффекторных клеток, у них нет MHC-ограничения киллинга Т-лимфоцитов, поэтому они более эффективны против различных линий опухолевых клеток (включая NK-чувствительные K562 и NK-нечувствительные Hela, HL60, клеточную линию острой Т-клеточной лимфомы человека OCRF-CEM, клеточные линии лимфомы человека OCI-LY8 и LAM53, клеточную линию рака толстой кишки человека OCRF-CEM, клеточную линию лимфомы человека OCI-LY8 и LAM53). LAM53, клеточные линии рака толстой кишки человека HT-29, CR75, клеточная линия рака почки человека A704) и свежая опухолевая ткань проявляли мощную киллинговую активность. 4. одинаково чувствительны к мультирезистентным опухолевым клеткам Вольф индуцировал мультирезистентные клеточные линии K562/DOX и CCRF-CEM-VBL адриамицином и винкристином и обнаружил, что клетки CIK проявили мощную киллинговую активность как против химиочувствительных родительских клеток, так и против нечувствительных трансформированных клеток, без различий между двумя сравнениями. 5. Иммунодепрессанты, такие как CsA и FK506, не влияли на киллинговую активность опухоли Мехта заметил, что хотя иммунодепрессанты CsA и FK506 могли ингибировать процесс дегрануляции клеток CIK, опосредованный анти-CD3 моноклональным антителом, они не влияли на дегрануляцию клеток CIK, вызванную клетками-мишенями, и в результате киллинговая активность клеток CIK против клеток-мишеней не снижалась. Seheffold исследовал влияние CIK-клеток на гемопоэтические клетки-предшественники костного мозга с помощью анализа на образование CFU-GM и обнаружил, что CIK-клетки убивали клетки K562 до степени 3, но подавляли GM-CFU менее чем на степень 1. Holye также продемонстрировал, что клетки CIK оказывали незначительное влияние на нормальный миелоидный клоногенез и демонстрировали лишь легкое ингибирование эритропоэза, что может быть связано с более высоким уровнем IFN-γ, секретируемого самими клетками CIK. 7. способность противостоять Fas-FasL апоптозу эффекторных клеток, запускаемому опухолевыми клетками Было показано, что важной причиной неудачи вторичной иммунотерапии является индукция апоптоза вторичных эффекторных клеток определенными белками (в основном FasL), экспрессируемыми на поверхности опухолевых клеток, в то время как клетки CIK не оказывают существенного влияния на их опухолеубивающую цитотоксичность, хотя и вызывают небольшое количество апоптоза, когда Fas занят. экспериментов предположил экспрессию антиапоптотических генов в CIK-клетках и обнаружил ап-регуляцию уровней транскриптов различных защитных генов, таких как cFLIP, Bcl-2, Bcl-X1, DAD1 и survivin. Также было обнаружено, что клетки CIK обладают способностью синтезировать FasL, а биологически активный водорастворимый FasL был обнаружен в супернатанте культур клеток CIK, что позволяет предположить, что клетки CIK могут противодействовать снижению или даже потере активности эффекторных клеток, вызванной FasL-положительными опухолями in vivo. Факторы, влияющие на киллинговую активность 1. Добавление экзогенных цитокинов Экспансия клеток CIK in vitro требует поддержки экзогенных цитокинов, таких как IL-2, IL-7 и IL-12, которые контролируют экспансию и биологическую активность различных антиген-специфических клеток в иммунной системе человека. Экзогенные IL-2, IL-7 и IL-12 могут значительно стимулировать рост лимфоцитов, особенно в присутствии IL-2 и IL-7, в то время как экзогенные IL-2, IL-7 и IL-12 не влияют на цитотоксическую активность CIK-клеток. Стимуляция экзогенными IL-2 и IL-7 снижала экспрессию соответствующих рецепторов на поверхности клеток CIK, тогда как молекулы CD28 были более высоко экспрессированы в присутствии IL-7, чем в присутствии IL-2. IL-12 снижал экспрессию ICAM-1 на поверхности клеток CIK, тогда как IL-7 увеличивал экспрессию CD56. ИЛ-7 значительно увеличивал долю CD4+ клеток по сравнению с ИЛ-2. Хотя небольшое количество апоптотических клеток может возникать при культивировании экзогенными IL-2, IL-7 и IL-12, некоторые исследования показали, что добавление экзогенного IL-12 увеличивает долю некротических клеток в клетках CIK. Лефтерова преинкубация анти-CD3McAb с клетками-мишенями увеличивала восприимчивость клеток CIK к киллингу, и это усиление частично блокировалось антителами против FcR (например, анти-CD36, анти-CD32). анти-CD3McAb), что косвенно свидетельствует о том, что повышенная киллинговая активность, вызванная анти-CD3McAb, связана с FcR-опосредованным связыванием антител. 2. Трансфекция генов нескольких цитокинов Поскольку экспансия клеток CIK зависит от экзогенных цитокинов, перенос соответствующих генов в клетки CIK путем переноса генов не только уменьшает количество используемых экзогенных цитокинов, но и увеличивает противоопухолевую активность самих клеток CIK. IL-7: Используя модифицированную аденовирусную трансгенную систему, Фитке трансфицировал клетки CIK геном человеческого IL-7 и обнаружил, что трансфицированные клетки могут производить высокие концентрации IL-7, до 1100 пг/106 клеток/24 ч. Синтезированный IL-7 обладал значительной биологической активностью и способствовал пролиферации трансфицированных клеток CIK значительно больше, чем нетрансфицированных. Экспрессия экзогенного IL-7 также изменяла секрецию других цитокинов клетками CIK, в частности TNF-α, чего не наблюдалось при добавлении IL-7 к нетрансфицированным CIK in vitro. Хотя различные поверхностные антигены, связанные с активностью по уничтожению клеток, такие как ICAM-1, не были значительно изменены на поверхности трансфицированных клеток CIK по сравнению с нетрансфицированными клетками CIK, способность трансфицированных клеток CIK убивать различные линии опухолевых клеток, такие как рак почки, злокачественная меланома и рак толстой кишки, была значительно повышена по сравнению с нетрансфицированными клетками CIK. IL-2: Лу и др. обнаружили, что экспрессия молекул CD56 во время культивирования клеток CIK зависела от IL-2, но присутствие только IL-2 уменьшало величину фенотипических изменений в культивируемых клетках CIK. Хотя некоторые эксперименты показывают, что для лечения клеток CIK in vivo не требуется постоянное поступление IL-2 in vitro, результаты Zoll и др. показали, что IL-2 в культуре in vitro способствовал пролиферации и киллинговой функции клеток CIK. Шмидт-Вольф ввел рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена IL-2 человека, в клетки CIK для лечения метастатических солидных опухолей методом электропорации и обнаружил, что после трансфекции клетки секретировали высокий уровень IL-2 (330-1,800 пг/106 клеток/24 часа, в среднем 836 пг/106 клеток/24 часа). Хотя до и после трансфекции не наблюдалось значительных изменений в экспрессии различных мембранных белков на поверхности клеток CIK, скорость пролиферации и активность уничтожения клеток трансфицированных клеток CIK была выше, чем у нетрансфицированных клеток в анализе in vitro. Процедура подготовки Клетки CIK были подготовлены путем забора периферической крови у пациентов, инкубации в CO2 инкубаторе при 37°C и 5% в течение 2 часов, отделения с помощью высокоскоростной центрифуги, сбора суспензии клеток и инкубации in vitro (имитируя среду in vivo человека) с различными цитокинами, такими как моноклональное антитело CD3, IFN-R, IL-2 и т.д. Культуральную среду меняли каждые 2-3 дня и собирали на 7, 11, 13 и 15 дни. Клетки CIK, CD3+ и CD56+ быстро увеличиваются, до 1000 раз больше, чем до культивирования. История разработки В 1985 году американские хирурги впервые обнаружили, что высокие дозы IL-2 in vitro могут культивировать лимфоциты в клетки с сильным опухолеубивающим эффектом, называемые LAK-клетками. Позднее добавление в культуральную среду моноклональных антител CD3 повысило опухолеубивающую активность этих клеток более чем в десять раз и увеличило количество экспансий, которые были названы CD3AK. Эти клетки пролиферируют чаще и обладают более высокой вирулентностью, чем клетки LAK. Впервые о CIK-клетках сообщили Шмидт Вольф и др. в Стэнфордском университете в 1991 году. Клиническое применение CIK-клеток в Китае и соответствующие политики и правила Уже в 1996 году в Китае были опубликованы научные работы по клиническому применению технологии лечения CIK-клетками, и более 100 медицинских учреждений в Китае провели клиническое применение и исследования этой технологии лечения. В соответствии с прогрессом клинического применения клеточной терапии в Китае и за рубежом, «Меры по клиническому управлению и применению медицинских технологий», изданные Министерством здравоохранения 1 мая 2009 года, включили «технологию аутоиммунной клеточной терапии» в список медицинских технологий класса III. [2] Показания к применению Клеточная терапия CIK является одной из форм вторичной клеточной иммунотерапии. Поскольку лизис клеток CIK не имеет ограничений по MHC, то есть не ограничен типом опухолевой ткани, он может уничтожить любой тип опухоли, но наиболее эффективен при раковых заболеваниях с высокой экспрессией антигена, таких как миелоидный лейкоз, меланома, почечно-клеточная карцинома, метастатический рак почек и неходжкинская лимфома. Клеточная терапия CIK также эффективна при других видах рака, таких как рак легких, толстой кишки, молочной железы, печени, желудка, колоректальный рак и т.д. Клеточная терапия CIK подходит для пациентов с любой стадией рака, но хорошо работает для пациентов с опухолями на ранней стадии или с низкой опухолевой нагрузкой после операции и радиотерапии. Она играет важную роль в устранении небольших остаточных поражений у пациентов после операции, радиотерапии или трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, предотвращении распространения и рецидива раковых клеток, повышении собственного иммунитета пациента и снижении токсических реакций. Терапия CIK-клетками может улучшить качество жизни и продлить время выживания с опухолью для некоторых пациентов, которые не подходят для операции и не переносят радиотерапию и химиотерапию. Особенности 1. Клетки CIK быстро пролиферируют, и противоопухолевые активные клетки могут размножаться в большом количестве, а их клеточная активность также значительно усиливается. 2. клетки CIK обладают механизмом распознавания опухолей и не оказывают токсического действия на нормальные клетки. 3. Обладая широким спектром уничтожения опухолей, клетки CIK могут быть использованы для лечения лейкемии, лимфомы, рака легких, рака желудка, рака кишечника и других опухолей, и одинаково чувствительны к опухолевым клеткам с множественной лекарственной устойчивостью. 4. Это типичная модель персонализированной биологической терапии. Инфузия этих клеток обратно в организм также усиливает иммунные возможности организма и производит специфический противовирусный эффект, оказывая, таким образом, двойное воздействие на лечение опухолей. 5. поскольку клетки CIK являются активированными аутологичными клетками, их использование очень безопасно. Эффективные CIK-клетки непосредственно подавляют рост опухолевых клеток и вызывают апоптоз путем прямого киллинга и секреции различных цитокинов. Большинство клеток, выполняющих функцию киллинга, выполняют свою функцию сразу после переливания, с периодом полураспада от 2 недель до месяца. В состав перелитых клеток входят некоторые клетки памяти, которые могут сохраняться от нескольких лет до десятилетий и быстро активируются in vivo для уничтожения клеток-мишеней при встрече с соответствующими стимулами. Поэтому интервал между курсами терапии клетками CIK в принципе составляет один месяц, и рекомендуется провести три последовательных курса с интервалом в один месяц в первый раз, а затем по одному курсу каждые шесть месяцев.