Анализы Методы выявления вирусных антигенов и антител в биологических жидкостях ВИЧ-инфицированных пациентов просты в исполнении и легко применимы повсеместно, особенно распространен анализ на антитела. Однако статус и значение анализов на антиген ВИЧ Р24 и вирусные гены в выявлении ВИЧ-инфекции также привлекают все больше внимания.
Анализ на антитела Антитела к ВИЧ в сыворотке крови являются косвенным показателем ВИЧ-инфекции. В соответствии с основной областью применения, существующие методы тестирования антител к ВИЧ можно разделить на скрининговые и подтверждающие тесты.
Подтверждающие реагенты Наиболее часто используемым подтверждающим тестом для положительных сывороток, полученных в результате скрининговых тестов, является Вестерн блот (ВБ), который подходит только в качестве подтверждающего теста из-за относительно длительного периода «окна», несколько низкой чувствительности и высокой стоимости. Другим скрининговым тестом, одобренным FDA, является анализ иммунофлюоресценции (IFA), который дешевле, чем ВБ, и относительно прост в проведении, весь процесс занимает 1-1,5 часа. Основным недостатком этого метода является то, что он требует дорогостоящего детектора флуоресценции и опытных специалистов для наблюдения и оценки результатов, а результаты нельзя хранить в течение длительного времени. В настоящее время FDA рекомендует отрицательный или положительный IFA при выдаче окончательных результатов донорам крови, чей ВБ не может быть определен, но не как критерий пригодности крови.
Скрининговый тест Скрининговый тест в основном используется для скрининга доноров крови, поэтому он требует простоты в эксплуатации, низкой стоимости, а также чувствительности и специфичности. В 2012 году основным методом скрининга в мире по-прежнему является ИФА, существует несколько реагентов для агглютинации частиц и быстрых реагентов для ИФА. ИФА обладает высокой чувствительностью и специфичностью, прост в эксплуатации, нужна только лаборатория, оснащенная ферментным маркером и мойкой для пластин. Он особенно подходит для использования в крупномасштабном скрининге в лабораториях.
Тест агглютинации частиц — еще один простой и удобный в эксплуатации, недорогой метод обнаружения, результаты метода можно определить невооруженным глазом, высокая чувствительность, особенно подходит для развивающихся стран или большого количества скрининговых доноров крови, недостатком является то, что необходимо использовать свежие образцы, специфичность низкая.
Спот-блот анализ (Dot-blot assay), разработанный в конце 80-х годов, является быстрым методом ИФА (Rapid ELISA), который чрезвычайно прост в эксплуатации, процесс короткий, большая часть процесса может быть завершена в течение 5-10 минут или даже 3 минут, но метод намного дороже, чем ИФА и реагенты для агглютинации частиц.
Набор для определения антител к вирусу иммунодефицита человека в слизистом экссудате полости рта (метод коллоидного золота) относится к категории латеральной иммунохроматографии (иммуноферментный анализ с использованием золота) и представляет собой реагент для экспресс-диагностики на основе иммунохроматографической технологии, который может быть использован для определения антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в образцах слизистого экссудата полости рта путем ручного управления, считывания результатов невооруженным глазом и получения качественных результатов через 20 минут. Его можно использовать для добровольных консультационных тестов, неохотного забора крови и первичного скрининга пациентов с головокружением от уколов. Метод подходит для первичных скрининговых тестов, и каждый, у кого этот реагент определит положительный результат, должен пройти дальнейшее обследование для подтверждения.
Вич отрицательный] означает, что антитела к ВИЧ не обнаружены в организме человека, и отрицательный символ обозначается (-). Это зависит от того, когда был проведен тест. В период «окна» организм инфицированного человека еще не выработал антитела к ВИЧ или еще не выработал достаточное количество антител к ВИЧ, когда тест на ВИЧ отрицательный, если тест проводится после периода «окна», возможность заражения ВИЧ можно исключить.
[ВИЧ положительный] означает, что антитела к ВИЧ обнаружены в организме человека, положительный символ обозначается (+).
Факторы неопределенных результатов теста Инфекция все еще находится в периоде окна: период от попадания ВИЧ в организм до проведения теста недостаточно длителен, поэтому в сыворотке крови еще не сформировался типичный ответ антител СПИД прогрессирует до конечной стадии, уровень антител снижается Перекрестная реакция других антител к невирусным белкам: аутоиммунные заболевания, некоторые злокачественные заболевания, беременность, переливание крови или трансплантация органов и т.д., организм может вырабатывать некоторые антитела, реакция которых схожа с реакцией, вызванной антителами к основному белку ВИЧ P24, очень похожа.
Обнаружение антигена Обнаружение возбудителя в основном относится к прямому обнаружению вируса или генов вируса из образцов хозяина путем выделения и культивирования вируса, электронно-микроскопического морфологического наблюдения, обнаружения вирусного антигена и генетического анализа. Поскольку первые два метода сложны и требуют специального оборудования и специалистов. Поэтому для клинической диагностики можно использовать только обнаружение антигена и RT-PCR (обратная транскрипция-PCR). Определение антигена ВИЧ-1 P24 может быть использовано в качестве вспомогательного метода при диагностике неопределенности или периода окна антител ВИЧ-1; вспомогательного метода при ранней дифференциальной диагностике младенцев, рожденных от ВИЧ-1 антитело-положительных матерей; положительного теста ВИЧ-1 антиген/антитело ИФА реагента четвертого поколения, но тест на антиген P24 обычно проводится с использованием сэндвич-реагентов ИФА с двойным антителом, которые должны быть одобрены и зарегистрированы SDA, а положительный результат должен быть подтвержден тестом нейтрализации в соответствии с инструкцией к реагенту. Отрицательный тест на антиген ВИЧ-1 P24 означает только отсутствие реакции в данном тесте и не может исключить ВИЧ-инфекцию, поэтому обычно не используется в клинической практике в качестве рутинной диагностики.
Тестирование нуклеиновых кислот ВИЧ может использоваться для диагностики ВИЧ-инфекции, мониторинга течения заболевания, составления плана лечения и определения его эффективности, а также для прогнозирования прогрессирования заболевания. Обычно используемые методы тестирования вирусной нагрузки ВИЧ включают анализы ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR), анализы амплификации последовательности нуклеиновых кислот (NASBA), анализы гибридизации разветвленной ДНК (bDNA) и методы флуоресцентной количественной ПЦР в реальном времени. Стоит отметить, что каждая система количественного определения РНК ВИЧ имеет свой минимальный предел обнаружения, то есть наименьшее число копий или международную единицу, которая может быть измерена. Положительный тест на нуклеиновую кислоту ВИЧ может использоваться как вспомогательный показатель для диагностики ВИЧ-инфекции и не может быть использован только для диагностики ВИЧ-инфекции. При сообщении результатов количественного теста на нуклеиновую кислоту ВИЧ результаты следует сообщать в соответствии с показаниями прибора, с указанием использованного экспериментального метода, типа образца и объема образца, а если результат измерения меньше минимального предела обнаружения, следует указать уровень минимального предела обнаружения.
Количественный тест на нуклеиновую кислоту ВИЧ также может использоваться в качестве вспомогательного показателя при диагностике ВИЧ-инфекции и в фундаментальных исследованиях, таких как анализ генетических подтипов и вариантов ВИЧ. Обычно используются методы ПЦР или РТ-ПЦР с применением амплификационных реагентов, обычных для лабораторий молекулярной биологии. Праймеры могут быть получены из литературы или разработаны пациентом, при этом следует стремиться охватить все или общие штаммы, или же может использоваться комбинация праймеров. Условия реакции и использованные последовательности праймеров должны быть указаны в отчете о результатах качественного анализа. Кроме того, используя преимущества высокой чувствительности методов выявления нуклеиновых кислот, применение анализов с объединенной амплификацией нуклеиновых кислот и методов объединенного тестирования нуклеиновых кислот образцов из популяций с высоким подозрением на инфекцию и отрицательными антителами позволяет своевременно выявлять инфекции в фазе окна. Этот метод более экономически эффективен, чем тестирование нуклеиновых кислот в одном образце.
Культурные методы Распространенным методом является ко-культура, в которой одноядерные клетки выделяются из нормальной периферической крови человека, стимулируются и культивируются с PHA, а затем добавляются к одноядерным клеткам пациента для диагностики и исследования на СПИД.
После того, как собственные лимфоциты периферической крови или костного мозга пациента стимулируются PHA в течение 48-72 часов и культивируются in vitro (в культуральную среду добавляется IL2) в течение 1-2 недель, пролиферация вируса может выйти во внеклеточное пространство, и клетки сливаются в многоядерные гигантские клетки, которые в конечном итоге разрушаются и умирают. Клетки также можно выделить и пассировать, используя пассированные линии лимфоцитов, такие как клетки HT-H9 и Molt-4.
Распространенность ВИЧ-инфекции у животных узкая, только шимпанзе и гиббоны, и обычно для экспериментов используются шимпанзе. Заражение шимпанзе клетками ВИЧ или бесклеточным фильтратом ВИЧ, или переливание крови ВИЧ-инфицированных шимпанзе нормальным шимпанзе прошло успешно, и ВИЧ постоянно выделялся в крови и лимфатической жидкости в течение 8 месяцев, а ВИЧ-специфические антитела обнаруживались через 3-5 недель и продолжали поддерживаться на определенном уровне. Однако после заражения ни у шимпанзе, ни у гиббонов не возникло никаких заболеваний.