Большинство бородавок можно диагностировать невооруженным глазом, но некоторые не могут быть диагностированы клинически в течение некоторого времени, и для постановки диагноза требуется лабораторное исследование или использование других реактивов, как, например, в случае плоских бородавок, для которых требуется серологический тест на сифилис. Ниже перечислены некоторые из часто используемых тестов.
На самом деле вы сможете получить гораздо больше, чем просто несколько самых популярных и наиболее востребованных.
Основной целью теста с уксусной кислотой является выявление субклинической инфекции ВПЧ, особенно у женщин с цервикальной субклинической инфекцией ВПЧ. Он подходит для общеклинических и эпидемиологических исследований благодаря хорошей чувствительности и простоте.
Хорошо известно, что субклинические ВПЧ-инфекции встречаются гораздо чаще, чем клинически выраженные поражения, и могут быть обнаружены только с помощью специальных методов. Субклинические инфекции ВПЧ первоначально обнаруживаются в шейке матки, а затем в женской вульве, мужском половом члене и перианальной области. Субклинические инфекции ВПЧ могут быть обнаружены самостоятельно или в виде бородавок, видимых невооруженным глазом. В последние годы ряд исследований подтвердил связь между ВПЧ-инфекцией и неоплазией, поэтому субклинической ВПЧ-инфекции уделяется все больше внимания. Существует ряд лабораторных методов выявления ВПЧ-инфекции, включая иммунологические методы, методы молекулярной гибридизации дезоксирибонуклеиновой кислоты и полиморфную ферментную цепную реакцию. Серологические тесты пока недоступны, а ВПЧ нельзя культивировать. Хотя вышеперечисленные экспериментальные методы обладают определенной чувствительностью и специфичностью, их трудно применять в общей клинической и эпидемиологической практике, поскольку они требуют более сложного лабораторного оборудования и техники. В последние годы некоторые ученые предлагают использовать способность уксусной кислоты отбеливать инфицированные ВПЧ участки для выявления субклинической ВПЧ-инфекции, предполагая, что этот метод в сочетании с методикой амплификации будет более простым, применимым и точным. Если сначала этот метод использовался для выявления подозрительных участков ВПЧ-инфекции на женской шейке матки, то в последнее время интерес переключился на выявление субклинических повреждений у мужчин — половых партнеров женщин с генитальными бородавками или интраэпителиальными наростами. В недавнем исследовании 72% из 51 мужчины — полового партнера женщин с гистологическими проявлениями condyloma acuminatum были идентифицированы при кольпоскопии как имеющие бессимптомную ВПЧ-инфекцию после нанесения 5% раствора уксусной кислоты на нормальную кожу пениса.
Метод и обоснование
Ватный тампон, смоченный в 3% — 5% растворе уксусной кислоты, прикладывался к предполагаемому поврежденному участку кожи, и результат отбеливания (также известный как белый ацетат — ацетонхит) обычно наблюдался через 1 минуту. Однако на женской вульве отбеливание уксусной кислотой можно наблюдать только через 3-5 минут. У мужчин при осмотре половой член и мошонка должны быть покрыты марлей, смоченной 3% — 5% уксусной кислотой, на 3 — 5 минут, а затем внешнюю кожу следует осмотреть при 10 — 16-кратном увеличении для поиска скрытых бородавок или участков побеления уксусной кислотой. Для уверенного отбеливания перианального поражения может потребоваться более длительное время, обычно 15 минут. Тест с белым ацетатом был усовершенствован благодаря использованию методов увеличения и особенно одновременному использованию кольпоскопического наблюдения, что делает область белого ацетата более видимой при кольпоскопическом увеличении, но в большинстве случаев достаточно использования простой лупы.
Механизм действия теста с белым ацетатом, который делает незаметные бородавки видимыми невооруженным глазом, не выяснен. Одна из теорий предполагает, что отбеливание является результатом коагуляции белка, и что этот белок отражает аномальные клетки и клеточные излишки, характерные для инфицированного ВПЧ эпителия. Другая теория предполагает, что инфицированный ВПЧ эпителий имеет другой кератин, чем нормальный неинфицированный эпителий, и что только первый может быть отбелен уксусной кислотой.
Презентация по кольпоскопии
После применения уксусной кислоты кольпоскопические признаки субклинической ВПЧ-инфекции шейки матки представляют собой блестящие, белоснежные поражения с неровными зазубренными, угловатыми или перьевидными краями. За пределами метастатической зоны имеются диффузные сателлитные поражения, при этом видны капилляры, обычно состоящие из сосудов одного калибра в рыхлом, дезорганизованном расположении, часто напоминающем сито на горизонтальной поверхности, а расширенные капиллярные коллатерали могут также выходить вертикально на поверхность, распространяясь по всему поражению с одинаковым диаметром канала. Если изображение сосудов недостаточно четкое из-за сужения мелких сосудов, вызванного уксусной кислотой, в лупу можно добавить зеленый фильтр, чтобы сделать изображение более четким.
Как и при кольпоскопии шейки матки, при кольпоскопии уксусной кислотой белая зона мужской генитальной ВПЧ-инфекции яркая, снежно-белая и блестящая. Стоит отметить, что 22% субклинических ВПЧ-инфекций у мужчин происходит в мошонке, которая может быть важным местом для передачи ВПЧ, поскольку мало внимания уделяется этой анатомической области как возможному убежищу для ВПЧ. Wikstrom классифицировал представление белого ацетата на мужских гениталиях на три типа, в зависимости от увеличения.
1. типичный: легко различимые, слегка приподнятые краевые повреждения, а также точечные центральные капилляры, связанные или не связанные с эпителиальными углублениями.
2. отчетливое, видимое повреждение с легко различимыми, слегка приподнятыми краями, но без отчетливых пунктированных капилляров.
3. атипичный: повреждение имеет высокий и неровный край и лишено пунктированных капилляров.
Клиническое применение
Исследование Викстрома показало, что 62% типичных и очевидных ВПЧ-инфекций при проведении теста с белым ацетатом совпали с результатами гистопатологического исследования. В отличие от этого, только 11% атипичных презентаций были последовательными. Если тест основан на результатах гистопатологического исследования, чувствительность теста с белым ацетатом составляет 85%, а специфичность — 12%. Если основываться на методах блоттинга нуклеиновых кислот и гибридизации in situ, то чувствительность составляет 85%, а специфичность — 11%. Благодаря чувствительности теста с белым ацетатом и простоте метода, не требующего сложной аппаратуры, он подходит для общеклинических и эпидемиологических исследований.
Белоацетатный тест в основном используется в клинической практике для выявления субклинических ВПЧ-инфекций. Поскольку большинство цервикальных ВПЧ-инфекций у женщин протекают субклинически, их можно увидеть только при использовании уксусной кислоты. У женщин кондиломы вульвы встречаются часто, но часто сочетаются с субклинической инфекцией, поэтому использование теста с белым ацетатом на вульве для выявления субклинической ВПЧ-инфекции позволяет определить источник рецидивирующих кондилом. Во-вторых, можно распознать субклиническую ВПЧ-инфекцию как возможную причину ранее необъяснимого вестибулярного зуда, чувства жжения и дискомфорта во время полового акта, что может сильно беспокоить пациента. Последнее состояние обычно имеет длительный характер и может быть ошибочно диагностировано как инфекция Candida, которая может только усугубляться при длительном и неэффективном лечении.
Субклиническая ВПЧ-инфекция мужских половых органов может вызывать небольшие, непальпируемые поражения, которые нелегко заметить невооруженным глазом, в частности папулы и пятнистые поражения, которые трудно обнаружить даже при очень детальном осмотре и которые могут выглядеть как четко очерченные «участки отбеливания уксусной кислотой» при использовании уксусной кислоты. Скрининг на субклиническую ВПЧ-инфекцию у мужчин высокого риска важен для профилактики рака шейки матки у женщин. Было высказано предположение, что мужчины с клинически незначительной ВПЧ-инфекцией могут быть источником потенциально онкогенных ВПЧ у женщин. В лондонском исследовании 75 мужчин — половых партнеров женщин с гистологически диагностированной цервикальной интраэпителиальной неоплазией (CIN grade III), у 49 (65%) была обнаружена гистологически подтвержденная пенильная ВПЧ-инфекция, у 16% — клинически видимые повреждения, а у 49% — субклиническая ВПЧ-инфекция, подтвержденная белым ацетатным тестом и кольпоскопией.
Субклиническая ВПЧ-инфекция встречается часто, и некоторые случаи, выявленные с помощью анализа на белок-ацетат, в принципе, должны лечиться, но на практике это трудно сделать. В настоящее время большинство клиницистов стараются удалять только те бородавки, которые видны невооруженным глазом, и не заботятся о выявлении субклинических повреждений. Тестирование на ацетат белого проводится только у пациентов с частыми рецидивами и при половом скрининге у пациентов с нормальным клиническим видом.
Первый из них — использование термина «пероксидаза».
Тест обычно проводится с помощью пероксидазно-антипероксидазного метода (т.е. PAP), который показывает вирусные белки внутри бородавки, чтобы продемонстрировать наличие вирусных антигенов в повреждении бородавки.
Первое, что вам нужно сделать, это заглянуть на сайт.
Берется небольшое количество ткани и окрашивается антителами, специфичными для вируса папилломы человека. Если в очаге поражения присутствуют вирусные антигены, то это означает наличие комбинации антиген-антитело. В методе пероксидаза-антипероксидаза (PAP) ядро может быть окрашено в красный цвет. Этот метод является специфичным и относительно быстрым и полезен для диагностики.
IV. Патологическое исследование
Основными признаками являются неполная кератинизация, высокая гипертрофия шиповатого слоя, папилломатозная гиперплазия, утолщение и удлинение эпидермальных выступов, которые могут напоминать псевдоэпителиомоподобную гиперплазию. Колючие клетки и базальные клетки имеют значительное количество ядерных делений и напоминают карциному. Однако клетки расположены регулярно, и граница между пролиферирующим эпителием и дермой четкая. Он характеризуется образованием характерных вакуолей в зернистом слое и в верхней части шиповатого слоя. Эти вакуолизированные клетки крупнее нормальных, со светлоокрашенной цитоплазмой и большим, круглым, глубоко базофильным центральным ядром. Гигантская кондилома Бушке-Левенштейна с экстремальным нисходящим эпидермальным ростом замещает нижележащую ткань и ее легко спутать со сквамозными клетками, поэтому требуется многократная биопсия. Если имеется тенденция к медленному прогрессированию, то это низкосортный злокачественный процесс, известный как веррукозная карцинома.
V. Генетическая диагностика
На сегодняшний день ВПЧ трудно обнаружить с помощью традиционных методов культивирования вируса и серологических методов, и основным методом диагностики является гибридизация нуклеиновых кислот. Метод ПЦР, разработанный в последние годы, обладает такими преимуществами, как специфичность, чувствительность, простота и быстрота, открывая новые возможности для выявления ВПЧ.
(i) Сбор и обработка образцов
1. Сбор образцов и предварительная обработка: Выделения и клетки берутся из влагалища и эктоцервикса с помощью скребка или ватного тампона, пропитанного физраствором. При проведении цитологического исследования образец помещают в 5 мл PBS, содержащего 0,05% тимеросал, дважды промывают PBS путем центрифугирования (3000 g, 10 мин), осажденные клетки ресуспендируют в 1 мл PBS и берут 0,5 мл клеточной суспензии для выделения ДНК.
2. Выделение нуклеиновых кислот из образцов: 1 объем суспензии клеток плюс 10-кратный объем раствора для лизиса клеток (10 ммоль/л Трис-HCl, pH 7,4, 10 ммоль/л ЭДТА, 150 ммоль/л NaCl, 0,4% SDS, 1,0 мг/мл протеиназы К) обрабатывали в течение ночи при 37°C; и равные объемы фенола/хлороформа (1:1), хлороформа/изо (24:1) дважды; добавьте 1/10 объема 3 моль/л NaAc (pH 5,2) и 2,5-кратный объем безводного этанола при -20°C на 2 ч или на ночь для осаждения ДНК; промойте один раз 1 объемом этанола; лизируйте 60 мкл раствора ТЕ (10 ммоль/л Трис-HCl, pH 8,0, 1,0 ммоль/л ЭДТА) и инкубируйте в течение 30 мин при 37°C.
(II) ПЦР-амплификация
1. Разработка и синтез праймеров: Геном ВПЧ можно разделить на ранний регион (E) и поздний регион (L), каждый из которых содержит ряд открытых рамок считывания (ORFs). Анализ последовательностей показал, что существуют консервативные последовательности в некодирующих областях каждого типа ВПЧ и в областях E1, E6, E7 и L1. Manos и др. разработали синтетические праймеры MY11 и MY09 из консервативных последовательностей в области L1 ВПЧ, как показано в таблице 1, которые имеют комплементарные последовательности с ВПЧ типов 6, 11, 16, 18 и 33 и могут также амплифицировать другие типы ВПЧ.
2. реактивы для реакции ПЦР: Taq ДНК-полимераза (2 U/мл), 10 ммоль/л резервуар dNTP (по 10 ммоль/л dATP, dCTP, dGTP и dTTP), 10× буфер для ПЦР (500 ммоль KCl, 40 ммоль/л MgCl2, 100 ммоль/л Трис-HCl, pH 8,5), 100 мкмоль/л резервуаров MY11 и MY09 и дистиллированной воды, приготовленной в стерилизованных стеклянных колбах.
3. Метод и процедура ПЦР-амплификации: для реакции амплификации использовали 100 мкл реакционного раствора ПЦР в стерильных 0,5 мл центрифужных пробирках из силиконизированного пластика.
(1) Предварительно смешанные реакционные реагенты были приготовлены и дозированы перед началом эксперимента. Предварительно смешанные реагенты включают все виды реагентов для ПЦР, кроме ДНК образца.
(2) Добавьте 10 мкл образца и 90 мкл премиксного реагента в каждую пробирку по очереди.
(3) Добавьте 80-100 мкл парафинового масла и быстро центрифугируйте в течение нескольких секунд на настольной центрифуге, чтобы каждый реакционный реагент собрался под слоем масла. Реактивы для ПЦР теперь коммерчески доступны в объеме 25 мкл, и добавляется только ДНК образца.
(4) Поместите реакционную пробирку на прибор для амплификации ПЦР с параметрами циклирования: 95°C в течение 30 с, 55°C в течение 40 с, 72°C в течение 50 с для 35 циклов и, наконец, 72°C для удлинения на 5 мин.
4. Для каждого теста следует установить положительный и отрицательный контроль. Рекомбинантная плазмида, содержащая ВПЧ (100 пг на реакцию) или ДНК клеточной линии, содержащей ВПЧ (например, Caski, HeLa) в качестве положительного контроля, и ДНК клеточной линии человека без ВПЧ в качестве отрицательного контроля.
(iii) Обнаружение и анализ продуктов амплификации
1.Гель-электрофорез: После реакции амплификации, удалите реакционную пробирку, охладите до комнатной температуры, возьмите 10 мкл продукта амплификации и проведите электрофорез в 5%-7% полиакриламидном геле или 1,5% агарозе, окрасьте бромистым этидием, проанализируйте результаты под УФ-анализатором, полоса ДНК появляется явно при молекулярном весе около 450bp.
2. гибридизация нуклеиновых кислот: Если при гель-электрофорезе нет четкой ДНК или необходимо определить специфичность полосы ДНК, для гибридизации по Саузерн-блоту и проверки спекл-гибридизации можно использовать меченый общий смешанный зонд и/или зонд, специфичный для конкретного типа.
Олигонуклеотидный зонд, меченный 32P АТФ, должен быть изготовлен в соответствии со стандартными методами и иметь удельную активность приблизительно 107 cpm/pmol. Гибридизационный раствор должен содержать 2 x 106-5 x 106 кпм зонда/мл. Гибридизацию проводят при 55°C в течение 2-3 ч при медленном встряхивании, после чего гибридизованную мембрану быстро промывают промывочным раствором (2 x SSC, 0,1% SDS) при 30-55°C для удаления избытка зонда. Затем мембрану промывали при различных условиях в зависимости от используемых зондов: для обычных гибридных зондов мембрану промывали при 55°C в течение 10 мин; для зондов MY12, MY13 и MY16 мембрану промывали при 56-57°C в течение 10 мин и повторно промывали один раз со сменой раствора; для зондов MY14 и WD74 мембрану промывали при 58-59°C в течение 10 мин и также повторно промывали один раз со сменой раствора.
Обнаружение ВПЧ методом ПЦР превосходит методы гибридизации нуклеиновых кислот. Его чувствительность высока. Метод GP-PCR может обнаружить 200 копий ДНК ВПЧ в образце при прямом анализе результатов с помощью гель-электрофореза, а если продукт ПЦР обнаруживается с помощью гибридизации нуклеиновых кислот, чувствительность повышается и может быть обнаружено 10 копий ДНК ВПЧ.
Учитывая высокую чувствительность метода ПЦР, использование эксфолиированных клеток из половых путей является достаточным для выполнения требований теста, что позволяет избежать необходимости проведения биопсии материала и измельчения ткани. Как правило, продукт амплификации ПЦР подвергается гель-электрофорезу, и полученную ДНК можно наблюдать для постановки прямого диагноза. Поэтому метод ПЦР для выявления ВПЧ является коротким, простым и быстрым.