I. Метод ABC (метод SP, LSAB, SABC с теми же шагами)
ABC (avidin-biotin comeplex) метод овальбумин-биотинового комплекса относится к технике аффинной иммуногистохимии, согласно биологическому свойству высокой аффинности овальбумин-биотина, биотин-пероксидаза получается путем объединения биотина с пероксидазой, а затем добавления овальбумина и биотина с образованием овальбумин-биотин-пероксидазного комплекса. Если в LSAB, S-P и SABC вместо овальбумина используется фермент с антибиотиновой белковой цепью, а вместо комплекса ABC — фермент с антибиотиновой белковой цепью (SA), меченный пероксидазой, то этапы те же, но скорость реакции выше из-за меньшего молекулярного веса SA и лучшего проникновения. Кроме того, SA имеет два сайта связывания с очень высокой аффинностью к биотину, и он не имеет биотина, прикрепленного к себе, который может связываться с биотином на вторичном антителе, поэтому ему легче связываться с биотином на вторичном антителе, чем ABC, поэтому он более чувствителен, и комплекс не нужно смешивать перед использованием, что проще и удобнее. ABC — это трехэтапный метод, и вторичное антитело представляет собой биотинилированный IgG (или IgM, IgA и т.д.), где Fab-фрагмент связывается с первым антителом, для этого необходимо соответствие с первым антителом. Если первое антитело — мышиное, то второе антитело должно быть антимышиным (или IgM, IgA и т.д.); если второе антитело — кроличье, то второе антитело должно быть антикроличьим (или IgM, IgA и т.д.), а также антителами овцы, крысы, лошади и других источников. Если используется универсальное вторичное антитело мыши и кролика, то нет необходимости разделять его, если первичное антитело мышиное или кроличье. ABC в 20-40 раз чувствительнее PAP из-за высокого сродства овальбумина и биотина. Наконец, пероксидаза на комплексе реагирует с проявителем цвета, образуя окрашенный преципитат, который можно наблюдать микроскопически. Лучшим хромогенным агентом для пероксидазы является DAB, который образует нерастворимые в воде коричневые частицы и может быть обезвожен спиртом и прозрачен ксилолом; если для развития цвета используется AEC, образуется красный преципитат, растворенный в воде, поэтому он не может быть обезвожен и может быть только запечатан водорастворимым герметиком, что не подходит для длительного хранения.
Шаги.
1.Разбавить депарафинизацию водой
2.Блокировка эндогенной пероксидазы (198 мл метанола или воды + 2 мл 30% H2O2) при комнатной
температуре в течение 20 мин. Промыть водой.
3, Восстановление антигена: (1) трижды промыть буфером TBS с рН 7,2, трипсиновое переваривание 37 ℃, 30 мин. Или (2) в соответствии с инструкциями: промыть дистиллированной водой, поместить в раствор для восстановления антигена (Ph6.0) в микроволновой печи 20 минут, или нагрев в электропечи 30 минут, или автоклав с крышкой из газа 3 минуты, быстрое охлаждение; или (3) в соответствии с инструкциями: без обработки).
4, промыть три раза буфером TBS с рН 7,2.
5, добавьте нормальную сыворотку по капле 37 ℃, 30 минут.
6, стряхнуть избыток сыворотки, добавить первичное антитело 37 ℃, 30 минут. Затем добавьте первичное антитело на 30 минут.
7, промыть три раза буфером TBS с рН 7,2.
8, добавьте вторичное антитело по капле, 37 ℃, 30 минут.
9. Промыть три раза буфером TBS с рН 7,2.
10. Добавить ABC комплекс по каплям, 37 ℃, 45 минут.
11, Промыть три раза буфером TBS с рН 7,2.
12.DAB развитие цвета в течение 3-10 мин.
13.Промывка водой.
14, Окрашивание гематоксилином, посинение, обезвоживание, прозрачность, герметизация.
II. Метод ПАП
Этапы.
1, депарафинизация участка в воде
2, блокирование эндогенной пероксидазы (198 мл метанола или воды + 2 мл 30% H2O2) при комнатной
температуре в течение 20 мин. Промыть водой.
3, восстановление антигена: (1) трехкратная промывка буфером TBS с рН 7,2, переваривание трипсином 37 ℃, 30 мин. Или (2) в соответствии с инструкциями: промыть дистиллированной водой, поместить в раствор для восстановления антигена (Ph6.0) в микроволновой печи 20 минут, или нагрев в электропечи 30 минут, или автоклав с крышкой из газа 3 минуты, быстрое охлаждение; или (3) в соответствии с инструкциями: без обработки).
4, промыть три раза буфером TBS с рН 7,2.
5, добавьте нормальную сыворотку по капле 37 ℃, 30 минут.
6, стряхнуть избыток сыворотки, добавить специфическое антитело по капле 37 ℃ в течение 30-60 минут или 4 ℃ на ночь, поместить во влажный бокс.
7, промыть PBS.
8.Добавить вторичное антитело по капле, 37 ℃, 30 минут.
9, промыть три раза буфером TBS с рН 7,2.
10, Добавить PAP антитело 37 ℃ в течение 30 минут.
11, промывка буфером pH7.2 TBS три раза, развитие цвета DAB в течение 3-10 минут.
12, промывка водой.
13, Окрашивание гематоксилином светлым, посинение, обезвоживание, прозрачность, герметизация.
III. Метод АПААП
APAAP: Он относится к методу немеченых антител, с помощью анти-щелочной фосфатазы антитела с высокой специфичностью и добавления большого количества щелочной фосфатазы к анти-ферментным антителам, так что щелочная фосфатаза полностью связана с анти-ферментным антителом, чтобы сформировать растворимый комплекс APAAP, обычно используемый проявитель цвета BCIP / NBT, твердый красный или твердый синий. Особенности не будет реагировать с эндогенной пероксидазы, так что фон чище, особенно подходит для тканей с более эндогенной пероксидазы, таких как печень и почки.
Шаги.
1, депарафинизация секции до воды (замороженные секции или мазки клеток, замоченные в PBS на 3 минуты, без восстановления антигена).
2, блокировка эндогенной пероксидазы (198 мл метанола или воды + 2 мл 30% H2O2) при комнатной
температуре в течение 20 мин. Промыть водой.
3, восстановление антигена: (1) трижды промыть буфером TBS с рН 7,2, трипсиновое переваривание 37 ℃, 30 мин. Или (2) в соответствии с инструкциями: промыть дистиллированной водой, поместить в раствор для восстановления антигена (Ph6.0) в микроволновой печи 20 минут, или нагрев в электропечи 30 минут, или автоклав с крышкой из газа 3 минуты, быстрое охлаждение; или (3) в соответствии с инструкциями: без обработки).
4, промыть три раза буфером TBS с рН 7,2.
5, добавьте нормальную сыворотку по капле 37 ℃, 30 минут.
6, стряхнуть избыток сыворотки, соответствующее разведение специфических антител, 37 ℃ в течение 60 минут, или 4 ℃ на ночь.
7, промыть 3 раза TBS или PBS (pH 7,2).
8, Мостовое антитело, 37 ℃ в течение 40 минут или 1 час при комнатной температуре.
9, TBS или PBS (pH 7,2) промыть 3 раза.
10, Капельное добавление разведенного соответствующим образом комплекса APAAP, 37°C в течение 30 минут.
11, промыть 3 раза TBS или PBS (pH 7,2).
12.Добавление раствора субстрата AKP по каплям, 37℃ в течение 15-30 минут, промыть водой после появления положительного результата.
13.Окрашивание (ядерный твердый красный или гематоксилин или метиловый зеленый) в течение 1-2 минут, после регулярного ополаскивания, глицерин-желатин запечатывает пленку.
IV. Метод LDP (меченый декстран-полимер) (двухэтапный метод Envision)
Энзимно-меченый полимерный метод, применение технологии энзимно-меченого полимера, например, система обнаружения EnVison, использование пероксидазы хрена или щелочной фосфатазы, меченной на полимере глюкозы, а затем лигирование с вторичным антителом, образуя вторичное антитело EnVison; как и система обнаружения PowerVision, использование пероксидазы хрена или щелочной фосфатазы, меченной на аминокислотном фрагменте. Поскольку более 20 участков на полимере могут связываться с первичным антителом, а количество ферментов на полимере выше, этот метод более чувствителен, чем такие методы, как ABC и LSAB. Самое главное, поскольку на вторичном антителе системы LDP нет биотина, отсутствует перекрестная реакция с эндогенным связыванием биотина, как это наблюдается в ABC, S-P и других методах, что уменьшает неспецифическое окрашивание и делает фон более чистым.
Шаги.
1, раздел депарафинизации до воды
2, 0,3% метанольный раствор H2O2: блокировка эндогенной пероксидазы (198 мл метанола или воды + 2 мл 30% H2O2) в течение 20 мин при комнатной температуре. Промыть водопроводной водой.
3. Восстановление антигена: (1) трехкратная промывка буфером TBS с рН 7,2, переваривание трипсином при 37 ℃, 30 мин. Или (2) в соответствии с инструкцией: промывка дистиллированной водой, помещение в раствор для восстановления антигена (Ph6.0) в микроволновой печи 20 минут, или нагрев в электропечи 30 минут, или автоклав с крышкой из газа 3 минуты, быстрое охлаждение; или (3) в соответствии с инструкцией: без обработки).
4, промыть три раза буфером PBS с рН 7,2.
5, добавьте нормальную сыворотку по капле 37 ℃, 20 минут.
6, стряхнуть избыток сыворотки, добавить первичное антитело, 37 ℃, 30 минут.
7. Промыть три раза буфером TBS с рН 7,2.
8.Добавить вторичное антитело Envision по каплям, 37 ℃, 30 минут.
9, промыть три раза буфером TBS с рН 7,2.
10.DAB развитие цвета в течение 3-10 минут.
11.Промывка водой.
12.Окрашивание гематоксилином, посинение, обезвоживание, прозрачность, герметизация.
V. Метод двойного окрашивания
1, Депарафинизация участка в воде
2, Блокирование эндогенной пероксидазы (198 мл метанола или воды + 2 мл 30% H2O2) при комнатной температуре
20 мин. Промыть водой.
3, Восстановление антигена: (1) трижды промыть буфером TBS с рН 7,2, трипсиновое переваривание 37 ℃, 30 мин. Или (2) в соответствии с инструкциями: промыть дистиллированной водой, поместить в раствор для восстановления антигена (Ph6.0) в микроволновой печи 20 минут, или нагрев в электропечи 30 минут, или автоклав с крышкой из газа 3 минуты, быстрое охлаждение; или (3) в соответствии с инструкциями: без обработки).
4, pH 7,2 TBS буфера мыть три раза.
5, капельно добавить нормальную сыворотку 37 ℃, 30 минут (можно не использовать).
6, стряхнуть избыток сыворотки, добавить первичное антитело 37 ℃, 30 минут.
7, промыть три раза буфером TBS с рН 7,2.
8. Добавить биотинилированное вторичное антитело по каплям, 37 ℃, 30 минут.
9. Промыть три раза буфером TBS с рН 7,2.
10. Добавить ABC или S-P комплекс (пероксидаза хрена) по каплям, 37 ℃, 45 минут.
11. Промыть три раза буфером TBS с рН 7,2.
12, окрашивание DAB (коричневый) или AEC (красный) в течение 3~10 мин.
13, промыть три раза буфером TBS с рН 7,2.
14, добавьте нормальную сыворотку по каплям при 37 ℃ в течение 30 минут (можно не добавлять).
15, стряхнуть избыток сыворотки, добавить второе первичное антитело 37 ℃, 30 минут.
16, промыть три раза буфером TBS с рН 7,2.
17, добавить биотинилированное вторичное антитело по капле, 37 ℃, 30 минут.
18. Промыть три раза буфером TBS с рН 7,2.
19. Добавить комплекс щелочной фосфатазы по каплям, 37 ℃, 30 минут.
20, Промыть три раза буфером TBS с рН 7,2.
21, развитие цвета BCIP/NBT (синий).
22, промывка водой
23, повторное окрашивание метиловым зеленым, обезвоживание, прозрачность и герметизация.
Если выбрать пероксидазу хрена, можно выбрать DAB (коричневый цвет), на шаге 21 с комплексом пероксидазы хрена, шаг 23 с AEC (красный цвет), но следует отметить, что AEC не может храниться в течение длительного времени. Если вы выбираете другую щелочную фосфатазу, можно использовать BCI/NBT, AP-Red, AP-Orange, с BCI/NBT развитие цвета лучше всего.
VI. Иммунозолотой метод (IGS)
(1) Срезы подвергаются обычной депарафинизации в воде.
(2) Переваривают 0,1% раствором трипсина при 37℃ в течение 10-30 минут.
(3) Промывают 2 раза дистиллированной водой.
(4) Промыть 0,05 моль/л TBS PH7.4 в течение 10 минут.
(5) Закрытие 1% овальбумином в течение 10 минут.
(6) Добавьте специфическое первичное антитело по каплям на 2 часа при комнатной температуре или на ночь при 4°C.
(7) Промыть 3 раза 0,5 моль/л TBS PH7.4.
(8) Закрытие 1% овальбумином в течение 10 мин.
(9) Разбавление антитела золотого стандарта в течение 45 мин при 37°C.
(9) 0,05 моль/л TBS PH7.4 в течение 3 раз.
(10) Промывка двойной дистиллированной водой 2 раза.
(11) 1% Халдол в течение 10 мин.
(12) Двойная промывка дистиллированной водой 3 раза.
(13) Повторное окрашивание, герметизация глицерином и наблюдение.
Результаты: Участок связывания коллоидного золота окрашен в красный цвет.
VII. Иммунозолотой и серебряный метод (IGSS)
(1) Срезы рутинно депарафинировали в воде.
(2) Участки тканей, фиксированные ртутьсодержащим фиксатором, обесцвечивали 0,5% спиртовым раствором йода, затем деиодировали в 0,5% водном растворе тиосульфата, промывали проточной водой, промывали дважды дистиллированной водой и промывали 0,05 моль/л раствором TBS PH7.4.
(3) Переваривание с 0,1% раствором трипсина, 37℃ в течение 10-30 минут.
(4) Промывка 0,05 моль/л TBS PH7.4.
(5) Закрытие 1% овальбумином в течение 10 минут.
(6) Титрование соответствующим разведением специфического антитела в течение 1-2 часов при 37°C или на ночь при 4°C.
(7) Промыть 3 раза 0,05 моль/л раствором TBS PH7.4.
(8) Закрытие 1% овальбумином в течение 10 минут.
(9) Титровать соответствующим разведением меченного золотом антитела при комнатной температуре в течение 45 минут при 37°C.
(10) Промыть 3 раза 0,05 моль/л TBS PH7.2.
(11) Промыть 2 раза дистиллированной водой и 2 раза дважды дистиллированной водой.
(12) Поместите в раствор для проявки серебра на 3-5 минут, избегайте света во время реакции.
(13) Промыть дистиллированной водой.
(14) Промывка водопроводной водой, повторное окрашивание гематоксилиновым светом.
(15) Обезвоживание, прозрачность, герметизация и наблюдение.
Результаты: Место связывания специфического антитела — серо-черные частицы, фон — прозрачно-серый, ядро — светло-голубое.
Приготовление реагентов.
Серебряный проявитель.
1, проявитель нитрата серебра.
(1) 10% водный раствор камеди арабской 60 мл, буфер лимонной кислоты pH 3,510 мл.
(2) 1,7 г гидрохинона плюс 30 мл дважды дистиллированной воды.
(3) 40 мг нитрата серебра плюс 2 мл дважды дистиллированной воды.
(1) и (2) две жидкости полностью растворить и смешать, перед использованием добавить (3), поставить в темное место для развития.
2. 0,05 моль/л TBS (pH 7,4).
Трис 12,1г,
NaCl 17,5 г,
Хорошо перемешайте для растворения, отрегулируйте pH до 7,4 с помощью концентрированной HCl, затем добавьте двойную дистиллированную воду до 2000 мл.