Тонизирующий метод является одним из распространенных способов лечения опухолей. В клинике ведутся споры о том, есть ли преимущества или недостатки в лечении опухолей этим методом. Большинство ученых считают, что тонизирующие препараты могут подавлять рост опухоли, продлевать выживаемость пациентов и улучшать качество их жизни [1], в то время как некоторые клиницисты полагают, что тонизирующие препараты будут способствовать росту опухоли и не должны чаще применяться в клинической практике. Для изучения влияния тонизирующих препаратов на опухоли мы выбрали тонизирующий препарат Сицзюньцзы Тан, чтобы проследить его влияние на скорость ингибирования опухоли и индукцию апоптоза опухолевых клеток у гормональных мышей. 1. Материалы и методы 1.1 Экспериментальные животные 60 мышей породы куньмин, массой 20 г±2 г, половина самцов и половина самок, были приобретены в Центре экспериментальных животных Первого военно-медицинского университета. Мыши содержались в отдельных клетках, их свободно кормили и поили, помещение для мышей проветривалось. 1.2 Клеточная линия В качестве клеточной линии использовали штамм асцитной опухоли мыши SRS-82, подкожная инокуляция которого позволяет получить саркому. Клеточная линия предоставлена Институтом фармацевтических исследований Университета Китая, регулярно реанимируется и культивируется. 1.3 Подготовка препаратов Препараты, использованные в данном эксперименте, были приобретены в аптеке больницы Наньфан, а инъекция 5-ФУ была произведена фармацевтической фабрикой Jiangsu Nantong Pharmaceutical General Factory (Su Wei Pharmaceutical Quarantine No. 241201). Состав препарата «Сицзюньцзы Тан»: женьшень — 9 г, атрактилодес макроцефала — 9 г, пория — 9 г, радикс и ризома глицирризы — 6 г. Приготовление: обычный водный отвар дважды, полученный отвар выпаривали и концентрировали на водяной бане при постоянной температуре 70 ℃, получали конечную концентрацию жидкости «Сицзюньцзы Тан» 0,33 г/мл (содержащей сырые препараты), которую хранили в холодильнике при температуре 4 ℃. Инъекцию 5-ФУ разводили до 3 мг/мл в стерильном физрастворе и хранили в холодильнике при температуре 4℃. 1.4 Создание модели мышиной опухоли с нагрузкой In vitro Реанимационная культура клеток SRS-82, собрать клетки в экспоненциальной фазе роста клеток, центрифугировать при 1000 об/мин, дважды промыть PBS, центрифугировать для удаления супернатанта и разбавить стерильным физраствором, доведя до 2~3×106/мл. 10 здоровых мышей Kunming были отобраны случайным образом, и каждой из них внутрибрюшинно вводили 0,4 мл вышеуказанной суспензии клеток, обращая внимание на наблюдение за инокулированными. Примерно через неделю брюшная полость инокулированных мышей была явно втянута и выпячена, из нее был извлечен асцит молочно-белого цвета, который был разбавлен стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:2 в стерильной пробирке, и в итоге было получено около 15 мл раствора для разведения асцита. Полученный асцитный раствор использовали для инокуляции 36 мышей породы Кунминг, каждой из которых подкожно вводили 0,2 мл раствора в правую заднюю конечность. 1.5 Распределение по группам и введение препаратов 36 мышей, успешно прошедших моделирование, были случайным образом разделены на 3 группы по 12 мышей в каждой и пронумерованы внутри групп. Лечение начинали со второго дня после моделирования: группе «Сицзюньцзы Тан» вводили приготовленный отвар «Сицзюньцзы Тан» по 0,5 мл один раз в день, группе «холостого контроля» — равное количество физраствора ежедневно, группе «5-ФУ» — внутрибрюшинно разбавленный 5-ФУ по 0,2 мл через день. После непрерывного лечения в течение 15 дней мышей умерщвляли, а опухоли сдирали. 1.6 Взвешивание опухоли и расчет скорости ингибирования опухоли Опухолевые блоки снимали, взвешивали на электронных весах и рассчитывали скорость ингибирования опухоли по общепринятой формуле. 1.7 Исследование морфологии и структуры опухолевых клеток с помощью просвечивающей электронной микроскопии Из каждой группы случайным образом отбирали по две мыши для проведения электронно-микроскопического исследования. После зачистки опухоли вырезали 0,5 мм3 опухолевой ткани и быстро фиксировали глутаральдегидом. После обезвоживания, инфильтрации, встраивания, секционирования, окрашивания и других этапов хорошо выполненные электронно-микроскопические срезы просматривались под просвечивающим электронным микроскопом. 1.8 Электрофорез в агарозном геле После подготовки реактивов ДНК выделяли и подвергали электрофорезу. 1% агарозный электрофорез, напряжение 60 В, время электрофореза 1,5 ч. 1.9 Статистическая обработка Все данные обрабатывали в программе SPSS10.0, использовали дисперсионный анализ (ANOVA) со случайным дизайном. 2 Результаты 2.1 Масса опухоли и скорость ее ингибирования Масса опухоли и скорость ее ингибирования в каждой группе представлены в табл. 1. Как видно из таблицы, масса опухоли в каждой из введенных групп значительно уменьшилась по сравнению с группой холостого контроля, причем опухолеподавляющий эффект группы 5-FU был наиболее очевидным, а масса опухоли — наименьшей (P<0,01); группа Tetrandrine Soup также имела очевидный опухолеподавляющий эффект (P<0,05). Таблица 1 Средний вес опухоли и скорость подавления опухоли в каждой группе Экспериментальная группа Вес опухоли (г) (х±с) Скорость подавления опухоли (%) Группа холостого контроля 4,78±1,53 Группа бульона "Сицзюньцзы" 4,03±1,23* 15,69 Группа 5-ФУ 3,12±1,08** 34,1 *P<0,05 по сравнению с группой холостого контроля, **P<0,01 по сравнению с 2.2 Трансмиссионная электронная микроскопия Наблюдения Вес опухоли в группе бульона "Сицзюньцзы" и группе 5-ФУ был наиболее очевидным (P<0,01). На большинстве срезов в группе и группе 5-ФУ наблюдались изменения некротических клеток: бледное окрашивание хроматина, набухание органелл и вакуолеподобные изменения. В обеих группах не наблюдалось большого количества клеток, претерпевающих характерные для апоптоза изменения. 2.3 Электрофорез ДНК в агарозном геле Характерными изменениями клеток, подвергшихся апоптозу, являются лестничные полосы ДНК, причем как в группе Сицзюньцзы Тан, так и в группе 5-ФУ явных лестничных полос не наблюдалось. 3.Обсуждение Результаты эксперимента показали, что масса опухоли в группе Сицзюньцзы Тан значительно уменьшилась по сравнению с группой холостого опыта, что свидетельствует о положительном влиянии препарата на подавление размеров опухоли и целесообразно для клинического применения при лечении опухолей. Морфология апоптотических клеток на начальном этапе представляла собой компактное ядро и сжатую цитоплазму, затем ядро фрагментировалось и превращалось в апоптотические везикулы, но остальные органеллы оставались интактными. Наиболее яркой биохимической особенностью является расщепление двойных связей ДНК между нуклеосомами с образованием фрагментов длиной 180-200 п.н., которые на электрофорезе в агарозном геле ДНК выглядят как "лестницы" [2]. В наших экспериментах при наблюдении под электронным микроскопом и выявлении на электрофорезе агарозного геля в группе Сицзюньцзы Тан не было обнаружено явных маркеров, характерных для апоптоза, а на электрофорезе агарозы не было характерных "лесенок" ДНК, поэтому мы не увидели типичных апоптотических изменений. Данное исследование показало, что препарат "Сицзюньцзы Тан" демонстрировал очевидную скорость ингибирования опухоли у гормональных мышей, а механизм его действия не был связан с индукцией апоптоза опухолевых клеток. Препарат "Сицзюньцзы Тан" обладает преимущественно тонизирующим действием и, возможно, не обладает эффектом прямого воздействия на зло. В экспериментах in vivo в группе Sijunzi Tang наблюдался значительный опухолеподавляющий эффект, который может действовать и по другим путям. В литературе имеются сведения о том, что тонизирующие препараты оказывают положительное влияние на иммунную функцию и время выживания гормональных животных в экспериментах in vivo [3]. Сицзюньцзы Тан может значительно повышать активность NK-клеток у гормональных мышей, и механизм противоопухолевого действия тонизирующих препаратов класса Сицзюньцзы Тан может заключаться главным образом в улучшении иммунной функции организма, повышении активности NK-клеток и LAK-клеток в организме и оказании косвенного убивающего действия [3], что позволяет достичь цели рассеивания зла путем поддержки позитива. Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что препарат "Сицзюньцзы", относящийся к тонизирующим средствам, способен значительно подавлять рост опухолей у гормональных мышей, что доказывает наличие у этого вида традиционной китайской медицины очевидного опухолеподавляющего действия in vivo. Препарат "Сицзюньцзы Тан" не вызывал апоптоза опухолевых клеток in vivo, и его воздействие на опухоли может быть достигнуто за счет других действий.