WU Hanqing WANG Bo ZHU Shikai ZHANG Jianjun WANG Chunyou WU Heshui* [Abstract] Цель Обнаружить экспрессию TLR9 в раке поджелудочной железы человека и клетках рака поджелудочной железы, исследовать влияние CPG ODN2216 на биологическое поведение клеток Panc-1 и изучить его клиническое значение. Методы Высокая экспрессия белка TLR9 в тканях рака поджелудочной железы была подтверждена иммуногистохимией, а его высокая экспрессия в клеточной линии рака поджелудочной железы Panc-1 была подтверждена иммунофлуоресценцией. Влияние CPG ODN2216 на клеточную адгезию, подвижность и пролиферацию исследовали с помощью клеточной адгезии, скрэтч-анализа, анализа вторжения, клонирования клеток и анализа МТТ на добавочную стоимость. Результаты показали, что как образцы рака поджелудочной железы человека, так и клеточная линия рака поджелудочной железы человека Panc-1 высоко экспрессировали TLR9, а клеточная адгезия и подвижность CPG ODN2216 были значительно ниже, чем у несеквенированной контрольной группы в анализе царапин, анализе адгезии in vitro, анализе инвазии в стромальный гель и анализе клеточного клонирования. Добавочная активность зависела от дозы во времени. Заключение Ген TLR9 связан с инвазивным метастатическим потенциалом рака поджелудочной железы человека, а использование экзогенного лиганда CPG ODN2216 может значительно подавить инвазивную и миграционную способность клеток рака поджелудочной железы человека Panc-1. 武汉协和医院急诊科吴汉青【关键词】CPG ODN2216, 胰腺肿瘤, Toll样受体9,细胞生物学 Influence of CPG ODN down-regulation on biology of pancreas cell line PANC-1 and the expression of TLR9 in human pancreatic cancerHan-Qing Wu, Bo Wang, Shi-Kai Zhu, Jian-Jun Zhang, Chun-You Wang, He-Shui WuDepartment of Pancreatic Surgery Center ,Union Hospital ,Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and Technology ,Wuhan Hubei 430022,ChinaCorrespondence to: Professor He-Shui Wu, Email:[email protected].[Abstract] Objective: To detect the expression of Toll-like receptor 9 (TLR9) in pancreatic cancer and investigate the effect of CPG ODN2216 on biological behavior of the pancreatic cell carcinoma, and to explore their clinical significance. Methods: The immunohistochemical method were used to examine the expression of TLR9 protein in the pancreatic cancer tissue and immunofluorescence staining was also performed to detect the TLR9 protein expression in pancreatic carcinoma cells．In vit TLR9, однако, является важным членом этого семейства и стимулирует экспрессию большого количества цитокинов и хемокинов, таких как интерлейкин (IL)-12, IL-6, интерферон-γ, ингибирующий белок моноцитов и металлоплазматические протеазы, В-клетками и дендритными клетками [2]. Для исследования роли гена TLR9 в панкреатическом канцерогенезе, после подтверждения его высокой экспрессии при раке поджелудочной железы, мы использовали синтетический олигодезоксинуклеотид 2216 (CPG ODN2216), специфический лиганд TLR9, для стимуляции клеток рака поджелудочной железы Panc-1, и наблюдали за ростом и пролиферацией клеток рака поджелудочной железы, опухолеродной способностью и Результаты показали, что ген TLR9 играет роль в развитии и росте клеток рака поджелудочной железы, и дают информацию для дальнейшего изучения специфического механизма гена TLR9. 1. Материалы и методы I. Экспериментальные материалы 1. Клетки: Клетки рака поджелудочной железы человека Panc-1 были предоставлены лабораторией общей хирургии больницы Union Hospital, Медицинского колледжа Tongji, Хуачжунского университета науки и технологии. 2. срезы тканей: 30 случаев свежих тканей рака поджелудочной железы человека и соответствующих параканкрозных тканей (1-2 см по краю опухоли) были получены от больных раком поджелудочной железы, 10 случаев образцов нормальной ткани поджелудочной железы были получены от неопухолевых пациентов, которым по другим причинам требовалась частичная панкреатэктомия. Все образцы были получены от пациентов с раком поджелудочной железы, прошедших хирургическое лечение в Центре хирургии поджелудочной железы Медицинского колледжа при Хуачжунском университете науки и технологии, и подтверждены послеоперационной патологией. 3. Основные реагенты: CpG-ODN2216 (последовательность GGGGACGATCGTCGGGGGGGG), синтезированный Shanghai Bioengineering Bioengineering Service Co. моноклональное антитело (компания Cell Signaling). Наборы для иммуногистохимии и флуоресценции (Wuhan PhD Company). трансвелл (Coring Company). гель матригеля (Sigma Company); МТТ с ДМСО (sigma Company). II. Экспериментальные методы 1. Иммуноцитофлуоресцентная химия: Клетки Panc-1 из рака поджелудочной железы переваривали трипсином для получения суспензии отдельных клеток, которую наносили на предметные стекла. Ползущие слайды удаляли в нужное время на 24 ч или более в зависимости от состояния роста клеток. три промывки PBS в течение 5 мин каждый раз, фиксация 4% параформальдегидом в течение 15 мин; три промывки PBS и перфорация 0,5% Тритоном в течение 20 мин; три промывки PBS и закрытие 5% БСА в течение 30 мин; после стряхивания жидкости, разбавленное первичное антитело добавляли непосредственно, а контрольную группу заменяли PBS Первичное антитело. Инкубировать в течение ночи при 4°C; промыть три раза PBS, добавить разведенное вторичное антитело и инкубировать в течение 1 часа при 37°C; промыть три раза PBS, добавить разведенное SABC-FITC и инкубировать в течение 30 минут при 37°C; промыть три раза PBS, запечатать водорастворимым герметиком и наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии. 2. Иммуногистохимия: парафиновые срезы депарафинировали и увлажняли в спирте. 3% перекись водорода замачивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Срезы были антигенно восстановлены в 0,01 мл цитратного буфера (pH 6,0). Срезы блокировали 5% козьей сывороткой BSA при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего блокирующий раствор отбрасывали. Добавить соответствующим образом разведенное первичное антитело, контроль с PBS вместо первичного антитела, на ночь при 4°C. Промыть 3 раза PBS по 5 минут каждый; добавить меченное биотином вторичное антитело и инкубировать 30 минут при комнатной температуре, промыть 3 раза PBS; добавить SABC и инкубировать 30 минут при комнатной температуре. промыть PBS, затем окрашивание DAB, повторное окрашивание гематоксилином, обезвоживание, прозрачность, блокирование и микроскопическое наблюдение результатов. 3. бромид дифенилтетразолия Метод синего (МТТ) для выявления пролиферации клеток рака поджелудочной железы: Переваренная суспензия клеток рака поджелудочной железы инокулировалась в количестве 1×103/лунку в 96-луночный культуральный планшет по 100 мкл на лунку. Инкубировали в условиях 37°C, 5% CO2 и насыщенной влажности, и после 24 ч осаждения клеток инкубировали с различными концентрациями (0,1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 5 мкг/мл, 10 мкг/мл). ) CPG ODN2216-активных клеток Panc-1, через 24 ч, 48 ч и 72 ч после инкубации, соответственно, добавляли 20 мкл МТТ в концентрации 5 мг/мл; супернатант отбрасывали на 4 ч, добавляли диметилсульфоксид, 150 мкл/лунку, встряхивали и перемешивали, а значение A измеряли при длине волны 490 нм с использованием ферментативного стандарта. Коэффициент ингибирования = (A контроль — A группа препаратов)/A контроль × 100% [3]. Строили кривую ингибирования пролиферации и измеряли половинную концентрацию ингибирования (IC50). 4. Анализ царапания: суспензию клеток Panc-1 при концентрации клеток 2×105/мл добавляли в 6-луночный планшет по 3 мл на лунку и инкубировали в течение 24 ч или дольше. После того как рост клеток достигал 80%, культуральную среду отбрасывали и добавляли CPG ODN2216 в концентрациях 1 мкг/мл и 10 мкг/мл, соответственно, и продолжали инкубировать в течение 24 ч. Супернатант отбрасывался, и скребок для клеток использовался для нанесения царапин на клетки в центре лунки. 4 отметки делались через равные промежутки времени по краю царапины в качестве точек данных, и для измерения бралось среднее значение. 5. анализ клеточной адгезии: 96-луночные планшеты были засеяны, высушены на воздухе, блокированы BSA и инкубированы в течение 60 мин; концентрация клеток контрольной и экспериментальной групп (CPG ODN 1 мкг/мл и 10 мкг/мл в течение 24 ч) была отрегулирована до (5×105)/мл, инокулировано 200 мкл/лунку, инкубировано в течение 1 ч, промыто PBS, добавлено 5 мг/мл MTT и инкубировано в течение 4 ч. Коэффициент ингибирования адгезии клеток (%) = (контрольная группа A — группа препарата A)/контрольная группа A × 100%. Для каждой группы клеток ставили три вторичные лунки и брали среднее значение. 6. Анализ инвазии клеток: 30 мкл геля искусственной цокольной мембраны добавляли в верхнюю камеру мембраны Transwell и высушивали на воздухе. 200 мкл (содержащих 1×105 клеток) клеток добавляли в культуру голодания на 24 ч соответственно, и концентрация CPG ODN была отрегулирована до 1 мкг/мл и 10 мкг/мл. 500 мкл нижней камеры инвазионной ячейки, содержащей 10 Через 24 ч камеры удаляли, а неперемещенные клетки и избыток жидкости в верхней камере вытирали ватным тампоном. Камеры фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 10 мин, а затем окрашивали 1% кристаллическим фиолетовым в течение 30 мин. Мембраны хорошо промывали деионизированной водой. Клетки наблюдали и подсчитывали под микроскопом. Три вторичные лунки были установлены для каждой группы клеток, и было взято среднее значение.7. Эксперимент по клонированию клеток: Клетки Panc-1 были переварены трипсином, продуты для получения суспензии клеток и инокулированы в 6-луночный планшет с примерно 200 клетками/лунка, установленными в качестве группы без CPG и концентрации 1 мкг/мл и 10 мкг/мл CPG соответственно, с 2 вторичными лунками для каждой группы клеток. Инокулированные клетки инкубировали в инкубаторе до 14 д. Культуру прекращали, когда клеточные клоны были видны невооруженным глазом, культуральную среду удаляли, промывали PBS, окрашивали гематоксилином в течение 30 мин, промывали PBS, подсчитывали скорость образования клеточных клонов и фотографировали в цифровом формате. Эксперимент повторяли три раза. 8. Статистический анализ: Экспериментальные данные анализировали с помощью программы SPSS13.0, все данные выражали как среднее ± стандартное отклонение. t-тест проводили, чтобы определить, были ли различия между экспериментальными данными каждой группы статистически значимыми. p