I. Предоперационная подготовка
Предоперационная подготовка такая же, как при фиброоптической бронхоскопии (фибронэктомии), БАЛ обычно проводится после фибронэктомии и перед биопсией. В качестве местного анестетика используется 2% лидокаин.
Техника проведения БАЛ
1.Выбор места для лаважа: При диффузном интерстициальном заболевании легких выбирают правую среднюю долю (B1 или B5) или левый язычковый сегмент легкого, а при ограниченном поражении легких проводят БАЛ в соответствующем бронхолегочном сегменте.
Полученную жидкость немедленно фильтровали через двойной слой стерильной марли для удаления слизи, регистрировали общее количество; помещали в силиконовую пластиковую бутылку или стерильный стеклянный контейнер с силиконовым покрытием (для уменьшения адгезии клеток), помещали в термос со льдом и немедленно отправляли в лабораторию. Слизь немедленно отправлялась в лабораторию для исследования.
Лабораторные тесты бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ)
I. Определение общего количества клеток и количества сортировок в БАЛФ
1. Вышеуказанная восстановленная лаважная жидкость упаковывалась в пластиковые центрифужные пробирки и центрифугировалась при 1200 об/мин в течение 10 мин при 4 ℃, супернатант (исходный раствор или 10-кратный концентрат) хранился при 70 ℃ и использовался для определения растворимых компонентов.
2. Клеточные компоненты, осажденные центрифугированием, дважды промывали раствором Хэнка (без Ca2+ и Mg2+) при тех же условиях, каждый раз в течение 5 мин. После отбрасывания супернатанта добавляли 3-5 мл раствора Хэнка для получения клеточной суспензии. Для уменьшения потери клеток можно также применять лаважный раствор.
3. Подсчитайте общее количество клеток в БАЛФ на модифицированном счетчике Нейбауэра, обычно оно выражается как 1 × 109/л. Если количество клеток слишком велико, следует увеличить количество клеток. Если количество клеток слишком велико, количество клеток доводят до 5 × 109/л путем разбавления раствором Хэнка, а пробирку погружают в колотый лед.
4. Сортировка клеток: Используя клеточный центрифужный мазок, добавляют 100 мкл суспензии запасных клеток (концентрация клеток 5 × 109/л) и центрифугируют при 1 200 об/мин в течение 10 мин при 4 ℃, чтобы распределить определенное количество клеток BALF непосредственно на предметном стекле путем центрифугирования. Слайды немедленно высушивали холодным воздухом, фиксировали в безводном этаноле в течение 30 мин, а затем окрашивали, обычно по Райту или HE.
5. Подсчет 200 клеток под 40-кратным световым микроскопом для сортировки клеток.
Выявление субпопуляции Т-лимфоцитов в БАЛФ
1. Методом непрямой иммунофлюоресценции полученные выше компоненты клеток BALF превращали в суспензию клеток с 3~5 мл 10% телячьей сыворотки в культуральной среде RPMI 1640.
2.Вылить клеточную суспензию в плоское блюдо и инкубировать в течение 2 часов в 5% CO2 инкубаторе при 37 ℃ для удаления альвеолярных макрофагов.
3.Удалите суспензию клеток, затем промойте раствором Хэнка и центрифугируйте один раз, отбросьте супернатант и оставьте 20-100 мкл. После обработки стенкой альвеолярные макрофаги значительно уменьшились, а лимфоциты относительно увеличились в клеточной суспензии.
4, обработанную стенкой клеточную суспензию разделили на три маленькие конические центрифужные пробирки, по 20-30 мкл в каждую пробирку, добавили 20-40 мкл моноклональных антител CD3, CD4 и CD8 к образцу с помощью микрошпателя и перемешали в холодильнике при 4 ℃ в течение 1~2 ч.
5, извлечь образец, сначала промыть раствором Хэнка и центрифугировать 2 раза при 12 000 об/мин в течение 20 с, затем добавить 20-40 мкл каждого козьего антимышиного флуоресцентного антитела и поместить в холодильник при 4 ℃ на 30 мин.
6. Выньте образец и дважды промойте его центрифугированием с раствором Хэнка при той же скорости и времени, отбросьте супернатант и оставьте 20 мкл для тщательного перемешивания клеток, возьмите 1 каплю на предметное стекло и накройте крышкой. Подсчитайте 200 лимфоцитов под флуоресцентным микроскопом и рассчитайте процент положительных клеток, меченных флуоресценцией.
Несколько замечаний:
1. Диаметр наконечника фибриноскопа, используемого для бронхоальвеолярного лаважа, должен быть около 5,5-6,0 мм, и он должен быть правильно зажат в бронхиальном отверстии сегмента или субсегмента, чтобы предотвратить смешивание секрета дыхательных путей и вытекание лаважной жидкости и обеспечить восстановление BALF.
2. Кашлевой рефлекс должен быть адекватно подавлен во время процесса лаважа, иначе легко вызвать повреждение слизистой стенки бронхов и смешивание лаважной жидкости, что также влияет на объем восстановления.
3, квалифицированный образец BALF должен быть: BALF без примеси атмосферных выделений; скорость восстановления > 40%, выжившие клетки составляют более 95%; эритроциты < 10% (за исключением травм / факторов кровотечения), эпителиальные клетки < 3% ~ 5%; морфология клеток в мазке не повреждена, без деформации, равномерное распределение. 4. Разбавление альвеолярной выстилающей жидкости варьируется из-за многих факторов, влияющих на обнаружение растворимых компонентов в BALF, таких как объем перфузии и объем восстановления, проницаемость альвеолярного эпителия и т.д. Хотя для стандартизации растворимых компонентов БАЛФ используются внутренние или внешние маркеры, все еще существуют различия в результатах тестирования, и их клиническая ценность ограничена, поэтому данный проект не регулирует метод обнаружения жидких компонентов БАЛФ. 5.Данная спецификация не подходит для проведения бронхиального лаважа (BL) и методов лаважа всего легкого с небольшим количеством жидкости. 6.Нормальные референсные значения цитологического теста BALF у здоровых некурящих людей: (1) Общая фракция клеток: общее количество клеток (0. 9-0. 26) × 109/л, включая альвеолярные макрофаги 0. 93 ± 0. 03, лимфоциты 0. 07 ± 0. 01, нейтрофилы и эозинофилы < 0. 01. (2) Подмножества Т-лимфоцитов: общие Т-клетки (CD3+) 0. 7, Т-хелперы (CD4+) 0. 5, Т-супрессорные клетки (CD8+) 0. 3, соотношение CD4+/CD8+ 1. 5 - 1. 8.