Колоректальный рак является одним из наиболее распространенных видов рака в Великобритании, ежегодно диагностируется 40 000 новых случаев, 5-летняя выживаемость составляет 55%, данные о стадировании до лечения доступны только для 23% пациентов с метастазами, а у 15% пациентов, перенесших операцию, все равно развиваются рецидивирующие метастазы.
Важным событием в лечении колоректального рака стало появление моноклональных антител, направленных против EGFR, включая цетуксимаб, бевацизумаб и панитумумаб. Имеющиеся данные ясно показывают, что анти-EGFR терапия неэффективна при KRAS-мутантном колоректальном раке.
Ранние данные, ограниченные кодонами 12 и 13 KRAS, позволили предсказать неэффективность лечения цетуксимабом, и NICE рекомендует результаты этого исследования для использования на практике. Цетуксимаб следует применять только при печеночном метастатическом колоректальном раке, и при определении пригодности пациента к данному лечению необходимо провести тестирование на мутации KRAS кодонов 12 и 13.
Тестирование на KRAS стало рутинным, чтобы помочь стратифицировать пациентов для анти-EGFR терапии. Другие организации за пределами Великобритании также рекомендуют тестирование гена KRAS для лечения колоректального рака.
Статья д-ра Вонга в журнале JCP, предназначенная для руководства клинической практикой в Великобритании, также освещает тестирование NRAS при колоректальном раке и рассматривает методы и исследования, повлиявшие на тестирование RAS при колоректальном раке, уделяя особое внимание практическим последствиям тестирования. Порядок статьи соответствует процедурам испытания образцов RAS.
Выбор случая
Обычное тестирование или тестирование по требованию
Вопрос о том, должно ли тестирование на RAS при колоректальном раке проводиться регулярно или по требованию, остается спорным. Модель рутинного тестирования означает, что все хирургически резецированные образцы регулярно проходят генетическое тестирование, а результаты описываются в патологоанатомическом заключении. Если в какой-то момент в будущем пациенту потребуется анти-EGFR терапия, эти молекулярные данные будут сразу же доступны.
Рутинное тестирование является хорошим решением проблемы длительного времени тестирования гена KRAS. Длительное время тестирования обусловлено не столько методом анализа, сколько временем, затрачиваемым на отбор подходящих тканей. Рутинное тестирование также предотвращает потерю блоков ткани, повреждение блоков ткани, которые неправильно хранились, или невозможность проведения тестирования RAS из-за использования в других тестах.
Недостатком рутинного тестирования является то, что оно не является необходимым для пациентов, у которых никогда не разовьются метастазы. Путь к сокращению ненужных исследований заключается в выявлении образцов колоректального рака с факторами высокого риска метастазирования, такими как наличие сосудистой инвазии, метастаз в лимфатических узлах или патологическое стадирование T4.
Самым большим недостатком рутинного тестирования является то, что новые данные свидетельствуют о том, что RAS — это нечто большее, чем просто мутации KRAS в кодонах 12 и 13. Если пациенту предстоит лечение анти-EGFR терапией и ранее он был протестирован на наличие кодонов 12 и 13 KRAS, то теперь пациент также будет протестирован на наличие мутаций NRAS и дополнительных мутаций KRAS.
Недавние исследования показали, что все больше генов связано с резистентностью к анти-EGFR терапии, и появляются новые таргетные методы лечения. Тестирование по требованию проводится только тогда, когда случай обсуждается многопрофильной командой и принимается решение о проведении соответствующего лечения. На момент написания статьи тестирование на RAS для пациентов с метастатическим колоректальным раком покрывается страховкой только для лабораторий в Великобритании, что означает, что тестирование по требованию теперь является основной практикой в Великобритании.
Для повышения доступности тестирования на RAS в Великобритании важно рационализировать распределение имеющихся ресурсов, разработать более рациональную систему тестирования, улучшить доступ к тканям колоректального рака и обеспечить своевременную доставку образцов для тестирования по требованию.
Первичная или метастатическая ткань
Во многих исследованиях изучалось, соответствуют ли мутации KRAS в тканях первичного или метастатического колоректального рака. Один мета-анализ показал очень высокую согласованность — 94,1%. Однако есть некоторые данные, свидетельствующие о том, что это соответствие связано с анатомическим расположением, при этом метастазы в легких и лимфатических узлах меньше совпадают с первичным очагом. Вышеупомянутый мета-анализ также показал совпадение 81,3% между метастазами в лимфатических узлах и первичным колоректальным раком.
Из-за отсутствия абсолютного генетического соответствия между первичными и метастатическими очагами предпочтительнее исследовать ткани метастатического колоректального рака, если они доступны и могут быть доставлены в лабораторию как можно скорее. Если метастатическая ткань недоступна, следует отправить ткань из первичного очага, поскольку на сегодняшний день нет достаточных доказательств того, что метастатическая ткань более специфична для генетического тестирования RAS.
Тип образца
Гистопатологические или цитологические образцы могут быть использованы для исследования RAS, включая срезы с использованием окрашивания HE или иммуногистохимического окрашивания. Некоторые образцы, такие как образцы эндоскопической или грубой игольной биопсии, имеют ограниченное количество образцов из-за техники получения образцов, а в случае эксцизионных образцов доступны несколько образцов опухоли, но обычно для исследования отбирается только один репрезентативный образец ткани. Ограниченное количество образцов вызывает ряд вопросов для рассмотрения.
Биоптаты, содержащие только аденомы
Первый — если у пациента есть четкие клинические и визуализационные признаки колоректального рака, но образец эндоскопической биопсии — только аденома, и это единственный образец, доступный для анализа на RAS. Что нужно сделать в этот момент? Одни считают, что образец аденомы не должен подвергаться исследованию, а первичный или метастатический участок должен быть подвергнут повторной биопсии; другие считают, что аденома должна быть исследована и сообщена, если выявлена мутация, но если мутации нет, это не доказывает, что опухоль не мутировала, и повторная биопсия все равно необходима.
Второй подход основан на том, что мутации RAS обычно возникают на ранних стадиях формирования опухоли и являются ключевыми мутациями-драйверами, и что демонстрация наличия мутаций RAS в аденомах предполагает, что колоректальные раки, развивающиеся из аденом, также могут иметь эту мутацию. Однако мутации RAS могут быть и поздним событием в колоректальном канцерогенезе, то есть аденомы могут быть RAS дикого типа, а аденокарциномы — RAS мутантного типа.
Третий подход похож на второй — тестирование на аденомы с гетерогенной гиперплазией высокой степени, состояние, более близкое к раку.
Гетерогенность мутаций внутри опухоли
Другой вопрос — какой из них выбрать, если есть несколько резецированных образцов? Эта тема связана с мутационной гетерогенностью опухоли, т.е. генетический фенотип различных клонов одного и того же колоректального рака может быть непоследовательным. Эндоскопические образцы обычно ограничены и поверхностны и могут быть не обнаружены, если мутантный клон расположен глубоко в опухоли, или они могут быть не обнаружены, если это резецированные образцы, где мутантный клон присутствует только в определенном тканевом массиве.
Исходя из последних данных по KRAS и NRAS, наличие любой одной мутации RAS обычно считается достаточным для прогнозирования резистентности к анти-EGFR терапии. Сосуществование более чем одной мутации RAS в одном и том же колоректальном раке не имеет дальнейшего клинического значения.
Более клинически значимым является наличие в одной опухоли как мутантных клонов RAS, так и клонов дикого типа, особенно если доля мутантных клонов невелика. Последнее относится к низкому уровню мутации, возможно, потому, что только небольшая часть мутировавших генов RAS присутствует в экстрактах ДНК колоректального рака, что необходимо отличать от низкого уровня злокачественных опухолевых клеток в тканевой массе, приводящего к разбавлению мутировавших генов в ДНК незлокачественных опухолевых клеток.
Некоторые данные свидетельствуют о том, что существуют также вариации генотипа KRAS в одной и той же ткани колоректального рака. Небольшая часть колоректальных раков представляет собой смесь клонов дикого типа и мутантных клонов KRAS с экзонами 2 и 3, и эта генотипическая вариабельность невелика: в 10/13 образцах определенный мутантный клон KRAS превышает 80% опухоли.
Недавнее исследование изучило мутации KRAS в 30 парных эндоскопических и резецированных образцах с помощью анализа кривой лизиса высокого разрешения и обнаружило, что генотипы были идентичны в каждой паре.
Более чувствительный метод был использован для изучения того, имеют ли колоректальные раки дикого типа более низкий уровень мутаций KRAS и влияет ли этот уровень мутаций на анти-EGFR терапию. 7-20% колоректальных раков дикого типа, выявленных с помощью секвенирования по Сэнгеру или ПЦР в реальном времени, имели мутации в кодонах 12 и 13 KRAS при повторном исследовании с помощью пирофосфатного секвенирования, проверочного набора Therascreen, ПЦР с целевыми нуклеиновыми кислотами или ПЦР с амплификацией мутаций. Эффективность анти-EGFR терапии колоректального рака при таком уровне мутации KRAS еще предстоит изучить.
С появлением более чувствительных тестов возможны особые успехи в изучении внутриопухолевой мутационной гетерогенности, и теперь клиническая работа может проводиться в соответствии с рекомендациями. Если доступны образцы как резекции, так и биопсии, для тестирования следует предпочесть блоки тканей; если доступна только ткань биопсии, а результатом является генотип дикого типа, в настоящее время недостаточно доказательств в пользу повторной биопсии для исключения мутаций низкого уровня.
Анализ на мутации не только влияет на выбор лечения, но, что более важно, наличие мутаций низкого уровня может быть предиктором будущей резистентности к анти-EGFR терапии. Часто предполагается, что эти мутантные клоны начинаются в низком количестве, но анти-EGFR терапия заставляет мутантные клоны разрастаться и проявлять устойчивость к терапии, когда их количество становится достаточным.
Влияющие факторы при подготовке
Был опубликован обзор, в котором подробно описано, какие факторы при подготовке образцов тканей могут повлиять на результаты последующего молекулярного тестирования, и следующие из них особенно актуальны для тестирования на RAS при колоректальном раке.
Большинство тканей колоректального рака, используемых для анализа на мутацию RAS, получают из биопсий, фиксированных в формалине, или хирургически резецированных первичных опухолей. Фиксация последних образцов часто задерживается или плохо фиксируется, в основном потому, что толстый кишечник не полностью иссечен или промыт, или взяты только частично фиксированные образцы.
Задержка или плохая фиксация приводит к деградации ДНК в результате апоптоза или некроза, а длительное погружение в формалин также деградирует ДНК в результате чрезмерного сшивания, снижая чувствительность обнаружения мутаций и увеличивая вероятность неудачи. Фиксация формалином также может вызвать деамидирование цитозина, что приводит к обнаружению антропогенных мутаций.
Фиксатор Буэна больше не используется в Великобритании, и ранее блоки ткани могли фиксироваться с помощью Буэна. Необходимо соблюдать осторожность, если ткань в блоке полностью пожелтела или если ткань содержит элюат, полученный в процессе выделения ДНК. Ткани с фиксацией по Буэну имеют более высокие шансы на неудачу при молекулярном тестировании, отчасти из-за длительности хранения тканей, а также потому, что некоторые компоненты фиксатора по Буэну могут ускорить разрушение нуклеиновых кислот.
В некоторых больницах принято закреплять образец на ацетатной полоске перед фиксацией образца эндоскопической биопсии, что может привести к еще более низкому выходу ДНК, если ацетатную полоску не удалить. Запись содержания опухолевых клеток подходит для молекулярного анализа. Технической разницы между секционированием или разрезанием ткани непосредственно для выделения ДНК нет, поскольку ткань должна быть выделена как можно быстрее после иссечения, чтобы уменьшить окисление ДНК.
Содержание злокачественных клеток
Когда соматическая мутантная ткань содержит как злокачественные, так и незлокачественные клетки, очень важно точно определить количественное содержание злокачественных клеток. Доля ДНК злокачественных опухолевых клеток в конечном экстракте ДНК является хорошим показателем доли злокачественных нуклеиновых кислот в гистопатологии всех нуклеиновых кислот и предпочтительнее измерения доли площади, занимаемой опухолями.
Это особенно важно при колоректальном раке, где некротические и бесклеточные участки не должны учитываться и по возможности должны быть удалены. Анеуплоидия хромосом часто встречается в опухолях и может потенциально повысить или понизить чувствительность обнаружения. В этом документе рекомендуется, чтобы минимальное количество опухолевых клеток, используемых для выявления мутации, в два раза превышало минимальное количество тестируемых опухолевых клеток.
Например, если метод требует наличия минимум 5% опухолевых клеток, то для тестирования на мутации подойдет минимум 10% злокачественных клеток в ткани. Существует вариабельность в оценке наблюдателями содержания опухолевых клеток при колоректальном раке, поэтому лаборатория хотела бы использовать безопасное минимальное содержание опухолевых клеток для анализа, но это соотношение нуждается в дальнейшем подтверждении.