Метилирование и деметилирование ДНК — это фактически несколько волн в притоке длинной реки эпигенетики, которая сейчас в полном разгаре. Метилирование ДНК — одна из первых эпигенетических модификаций, которая была обнаружена и признана, и включает в себя присоединение метильной группы (-CH3) к 5-му атому углерода пиримидинового кольца основания цитидина (C). Эта модификация происходит не на всех Cs последовательности ДНК, а в основном на Cs, которые встречаются вместе с CG (позже было обнаружено, что в эмбриональных стволовых клетках много метилирования происходит и на других Cs). Не обращайте внимания на эту небольшую модификацию, но она добавляет дополнительную информацию в ДНК, позволяя выразить богатое разнообразие генетической информации в ограниченном геноме. Возникает вопрос, что именно представляет собой эта дополнительная информация? Для начала метилирование ДНК понимается просто как «замок», где участки ДНК, отмеченные метилированием ДНК, — это в основном гены, с которых нужно «смахнуть пыль» и «посадить в тюрьму», например «Озорники» генома, транспозоны, контролируются «замком» метилирования, и если они не контролируются или плохо контролируются, эти «озорники» будут прыгать по геному. Если их не контролировать или не регулировать, эти «озорники» могут прыгать по геному, искажая его и вызывая множество проблем, например, развитие опухолей. Метилирование ДНК наиболее соответствует определению эпигенетического наследования; оно очень стабильно и наследуется на соматическом уровне, что означает, что «дочерние» клетки, образующиеся при делении соматических клеток, наследуют не только последовательность геномной ДНК «родительских» клеток, но и Это означает, что «дочерняя» клетка не только наследует последовательность геномной ДНК «материнской» клетки, но и очень точно копирует картину метилирования геномной ДНК «материнской» клетки. Однако во время формирования половых клеток, а также во время дифференциации оплодотворенной яйцеклетки в эмбрион, метилирование геномной ДНК подвергается массивному «ремоделированию» с очень коротким промежутком времени. Например, метилирование геномной ДНК сперматозоида, по-видимому, «очищается» до деления оплодотворенной яйцеклетки и начинает быстро восстанавливаться вскоре после деления оплодотворенной яйцеклетки. Также происходит ремоделирование метилирования во время формирования половых клеток (сперматозоидов и яйцеклеток). В связи с этим возникает важный фундаментальный вопрос: как происходит «очистка» метилирования ДНК за столь короткое время? Ключом к ответу на этот вопрос является поиск ДНК-деметилазы, которая может удалять метилированные группы из ДНК. Однако проблему было легко поставить, но нелегко решить. С момента первого предложения эта проблема заняла у многих людей более десяти лет, но она по-прежнему остается нерешенной! Причина этого заключается в том, что процесс деметилирования ДНК ограничен периодом после оплодотворения до деления яйцеклетки и образования половых клеток, с очень коротким промежутком времени и ограниченными источниками клеток для получения достаточного количества клеток или тканей для молекулярно-биологических манипуляций по идентификации генов, и еще меньше для биохимических манипуляций по очистке фермента, что делает его чрезвычайно трудным для изучения. Этот процесс деметилирования ДНК был большой загадкой в течение многих лет. Вопрос важный, но «собака кусает ежа, а добраться до него нет никакой возможности». Есть интерлюдия. Канадский биолог еврейского происхождения, профессор Шиф, много шутил о метилировании ДНК, но сошел с проторенной дорожки и в итоге стал альтернативным ученым, маргинальной фигурой в этой области. В его лаборатории был открыт фермент для деметилирования ДНК, который был опубликован в журнале Nature в 1999 году и вызвал сенсацию в обществе, но другие лаборатории не смогли его воспроизвести. Изучение деметилирования ДНК оставалось бездействующим в течение нескольких лет. В 2005 году открытие гистоновых деметилаз и каталитического механизма в лаборатории Ши Яна вызвало сенсацию и вдохновило людей на поиск и идентификацию ДНК-деметилаз. Лаборатория Шанг Йонгфенг из Пекинского университета сообщила о специфическом для генов «активном деметилировании ДНК» в клетках рака яичников, а лаборатория Чжу Хелс в США обнаружила и идентифицировала ДНК-деметилазы в растениях. Однако метилэстеразы ДНК млекопитающих до сих пор остаются «неопознанными» и «неизвестными». В 2008 году в журнале Nature были опубликованы две работы консорциума немецких и французских лабораторий, в которых сообщалось о локализованном активном деметилировании ДНК в клетках-носителях. В этот момент Бестор из Колумбийского университета, один из лидеров в области метилирования ДНК, выступил и прокомментировал историю в Cell с саркастическим оттенком (The colourful history of active DNA demethylation). Ранее биолог развития Ниерс из Гейдельберга сообщил в журнале Nature, что белок Gadd45a, вызывающий повреждения ДНК, способствует деметилированию ДНК, но тут же получил опровержение. Лаборатория Пфайфера из Института Бекмана в Калифорнии, США, опубликовала в журнале PLoS Genet статью, отвергающую результаты Ниерса, с говорящим названием: GADD45A не способствует деметилированию ДНК! Однако несколько последующих отчетов из разных лабораторий подтвердили результаты Ниерса. Тем не менее, остаются некоторые проблемы: 1) нокаут Gadd4a не препятствует эмбриональному развитию и не влияет на процесс деметилирования до оплодотворения; 2) CADD4a на самом деле не является ферментом деметилирования, он только запускает механизм репарации ДНК, называемый эксцизионной репарацией ядерной кислоты (NER), который в основном используется для восстановления повреждений ДНК, вызванных УФ-светом. Он лишь запускает механизм восстановления ДНК, называемый эксцизионной репарацией ядерных кислот (NER, в основном используется для восстановления повреждений ДНК, вызванных УФ-светом), который вырезает участок метилированной ДНК и синтезирует новую нить. Понятно, что этот механизм работает при локальном или индивидуальном ген-специфическом деметилировании, но боюсь, что он неприемлем в качестве общего механизма, участвующего в геномном перепрограммировании метилирования. Если использовать аналогию, если бы вы хотели изменить цвет стены, вы бы предпочли удалить кирпичи из стены и заменить их новыми, или просто удалить краску с кирпичей? Особенно если это большие изменения для целого здания? В конце концов, это вопрос эффективности, с одной стороны, и экономики — с другой. Наконец, в 2009-2010 годах ДНК-деметилаза заняла центральное место и стала новой сияющей звездой. Открытие и идентификация ДНК-деметилаз представляет собой две различные исследовательские модели (две исследовательские модели, два с половиной механизма, семь молекул). Гипотеза — это классическая модель научного исследования, в которой сначала формулируется гипотеза, а затем разрабатывается эксперимент для ее проверки. Гипотезы часто оказываются ошибочными, поэтому в целом это стратегия с высоким риском для нас. Для успеха в этой стратегии необходимы не только интуиция, воображение и смелость, но и опыт, прочный фундамент, и, конечно же, навыки логического мышления. Оценка научных исследований высокого уровня иногда может быть столь же интеллектуально приятной, как чтение детективов о Шерлоке Холмсе. В случае исследования деметилирования ДНК мы можем оценить два примера исследований, основанных на гипотезах. Во-первых, Анджана Рао, в прошлом иммунолог кафедры патологии Гарвардского университета, а ныне сотрудник Института метаболических исследований Ла Джолла в Калифорнии, была избрана в Американскую академию наук в 2008 году. Она изначально не принадлежала к сообществу эпигенетиков, но все есть все, и когда они наносят удар, они наносят большой удар, как Ши Янг, которая изначально не специализировалась на модификации метилирования гистонов, но была вдохновлена проникнуть на территорию эпигенетики и все же сделала удивительно важное открытие. Идея Рао о том, что деметилирование ДНК может происходить по механизму оксигенации (гидроксилирование или присоединение монооксигенации), возможно, была навеяна исследованиями модельного организма — африканской трипаносомы. В трипаносомах существует фермент JBP1, который присоединяет кислород (гидроксилирование) к метильной группе тимина с образованием гидроксильной группы, к которой другие ферменты затем присоединяют группу сахара, образуя таким образом уникальную структуру (названную J-структурой), которая, хотя и не удаляет исходную метильную группу, играет роль в регуляции экспрессии генов. Тимин и метилцитозин очень похожи по структуре (оба являются пиримидиновыми кольцами), с метильной группой в том же положении, и Рао предположил, что подобные ферменты и механизмы могут существовать в высших организмах. Основываясь на этой гипотезе, они провели несколько раундов поиска гомологии через белковые последовательности (PSI-blast) и, наконец, обнаружили три гена, Tet1, 2 и 3, в базах данных белков человека и мыши. Было также установлено, что эти гены преобладают в постнатальном филуме, что говорит о важности и сохранении этого функционального механизма. Проведя цитологический и биохимический анализы, они сделали два важных вывода: 1. они подтвердили, что все три белка имеют оксигенированную модификацию метилированного цитозина, но с разной интенсивностью активности, что должно было стать ожидаемым результатом их проекта; 2. метилированный цитозин катализируется реакцией оксигенирования с образованием новой модифицированной формы, гидроксил-метил-цитидина (hm-C). цитидин (hm-C), модификация, придающая ДНК новые эпигенетические свойства и информацию; это второе открытие было неожиданно незапланированным и может иметь еще более далеко идущие последствия. Сразу после этого они быстро продвинули свою работу дальше, связав эту модификацию с дифференцировкой гемопоэтических клеток (Science 2009), а затем обнаружили, что ее аномалии (мутации и делеции Tet2) тесно связаны с гематологическим опухолегенезом (Nature 2010). Звездная фигура в эпигенетике, И Чжан, также быстро вмешался в это время и обнаружил, что Tet1-опосредованные модификации гидроксиметилцитозина играют важную функцию в поддержании функции самообновления (обновления) стволовых клеток (Nature 2010). В 2011 году работы по модификации гидроксиметилирования ДНК стали регулярными в журнале Nature (Nature 18 Jul 2010; Nature 30 Mar 2011; Nature 03 Apr 2011; Nature, 13 April 2011, Cell 14 April 2011). Старый пес, новые трюки Это также типичный вывод, сделанный на основе гипотезы. Их теоретическая модель заключается в том, что урацил, образующийся в результате дезаминирования метилцитозина, может встречаться только в РНК, а если он встречается в ДНК, то либо потому, что клетка считает, что во время синтеза он был смешан с неправильным материалом, либо потому, что химически повреждено основание, короче говоря, клетка запускает репарацию эксцизии оснований (base excision repair). реакция (base excision repair, BER), которая имеет сходство с NER. Именно в этот момент молекула AID (базовая цитозиндеаминаза), которая, как было обнаружено в начале 1990-х годов, играет важную роль в способности иммунной системы развиваться, вошла в сознание тех, кто изучает ДНК-деметилазы. AID был первоначально клонирован в лаборатории известного японского иммунолога Хондзё Т. Клонирование и функциональное раскрытие AID стало важным шагом вперед в развитии В-клеток и формировании разнообразия антител. Система, которую использовали М. Азим Сурани и Вольф Рейк, на этот раз представляла собой первичные зародышевые клетки. В клетках с нокаутом AID обе лаборатории обнаружили, что деметилирование сперматозоидов было значительно нарушено, но все же частично происходило, что говорит о существовании других механизмов. В итоге они оба подтвердили, что деметилирование, вовлеченное в AID, осуществляется путем инициирования эксцизионной репарации оснований через дезаминирование метилированных цитозинов. Это все равно, что вытащить определенные части целого здания и заменить их новыми. Это недостаточно экономично, но это происходит, и мы можем доверять только фактам, а не опыту и здравому смыслу. Исследовательская модель 2: систематическая фильтрация Что, если нет ни подсказок, ни ключей, ни идей (гипотез)? Закиньте сеть и систематически ловите рыбу. Стивен Дж. Элледж сколотил свое состояние, создав мощную систему скрининга РНКи — сверхкрупную, сверхмощную «сеть». Он построил эту суперрыболовную систему, похожую на огромную рыбацкую лодку, оснащенную огромной сетью (чтобы поймать все гены), автоматизированную (система штрих-кодов + генный чип), и стал морским царем в функциональных геномных исследованиях. В 2009 году в лаборатории И Чжана в Северной Каролине был проведен гениальный эксперимент с использованием оплодотворенных яйцеклеток, в результате которого удалось открыть небольшую брешь. Сначала они разработали метод определения статуса метилирования геномной ДНК в живых клетках. В клетках существует класс белков, которые специфически распознают и связывают метилированную ДНК (MBD), и если MBD связан (слит) с зеленым флуоресцентным белком, это эквивалентно добавлению флуоресцентной метки к MBD, что позволяет непосредственно наблюдать и отслеживать местоположение MBD под микроскопом. В общем, MBD-GFP связывается с метилированной ДНК на геноме и появляется в виде зеленого пятна (фокуса) под флуоресцентным микроскопом; когда геномное метилирование удаляется, MBD-GFP больше негде связываться и поэтому он рассеивается в ядре, где под микроскопом эти первоначальные зеленые флуоресцентные пятна исчезают и становятся диффузными зелеными. Таким образом, изменения в геномном метилировании можно определить, наблюдая за изменениями флуоресцентного сигнала. С помощью этого индикатора суждений можно проводить скрининг. Выбранные гены «удаляются» по одному с помощью РНК-интерференции, после чего наблюдается сигнал флуоресценции. Если флуоресцентный сигнал в виде пятна в клетке оплодотворенной яйцеклетки не исчезает или исчезает очень медленно после вмешательства в работу гена, это говорит о том, что ген может быть вовлечен в процесс геномного деметилирования. Это был очень большой скрининг, в ходе которого было проверено 4 000 генов, и в итоге они нашли положительного кандидата, которым оказался транскрипционный фактор элонгации ELP3, точный механизм работы которого до сих пор не ясен. Недавно Сонг Хунцзюнь, китайский ученый из Медицинской школы Университета Джонса Хопкинса, опубликовал в последнем номере журнала Cell научную работу, в которой объединил катализируемую Tet1 реакцию гидроксиметилирования с катализируемой AID реакцией дезаминирования. Некогда железная плита деметилирования ДНК наконец-то открыта; конечно, там много золота и серебра, разве вы не хотите протиснуться туда и захватить немного?