Экспрессия и клиническое значение TLR9 при раке поджелудочной железы

Экспрессия и клиническое значение TLR9 при раке поджелудочной железы

WU Hanqing ZHU Shi-kai ZHANG Jian-jun YANG Zhi-yong WANG Chun-you WU Heshui*

[Аннотация] Цель Выявить экспрессию TLR9 в тканях рака поджелудочной железы и изучить ее клиническое значение. Методы Количественная ПЦР в реальном времени, иммуноблотинг и иммуногистохимия были использованы для выявления экспрессии TLR9 в 30 тканях рака поджелудочной железы и прилегающих к ним паранеопластических тканях и 10 нормальных тканях поджелудочной железы, а также для анализа связи между экспрессией TLR9 в тканях рака поджелудочной железы и патологической градацией, клинической стадией и метастазированием. Результаты Значение кратности амплификации мРНК TLR9 составило 2,32 (1. 41-3,22) в тканях рака поджелудочной железы и 1,23 (1,18-1,28) в паранеопластических тканях, со значительными различиями в экспрессии между двумя группами (t=2,642, P=0,023). Уровень положительной экспрессии белка TLR9 в раке поджелудочной железы составил 73,3%, 33,3% в параканкрозных тканях и 20% в нормальных тканях поджелудочной железы, демонстрируя тенденцию к снижению (c2 =13,99, P=0,001). Высокая экспрессия TLR9 при раке поджелудочной железы положительно коррелировала с дифференцировкой опухоли, стадией TNM и метастазированием в лимфатические узлы. Заключение TLR9 был высоко экспрессирован в тканях рака поджелудочной железы, а экспрессия TLR9 была связана со степенью опухоли, что позволяет предположить, что он может быть вовлечен в развитие рака поджелудочной железы через иммунные механизмы. Ву Ханьцин, отделение неотложной медицины, больница медицинского колледжа Уханьского союза

Ключевые слова】опухоль поджелудочной железы, рак, TLR9

Экспрессия TLR9 при раке поджелудочной железы и ее клиническое значение

Хань-Цин Ву, Ши-Кай Жу, Цзянь-Цзюнь Жанг, Чжи-Юн Ян, Чунь-Ю Ванг, Хе-Шуй Ву

Отделение Центра хирургии поджелудочной железы, Больница Юнион, Медицинский колледж Тунцзи, Хуачжунский университет науки и технологии, Ухань Хубэй 430022, Китай

Переписка: профессор Хе-Шуй Ву, Email:[email protected].

[Abstract] Objective: To detect the expression of Toll-like receptor 9 (TLR9) in pancreatic cancer, and to explore their clinical significance. Methods: The real-time RT-PCR technique, western blot method and immunohistochemical method were used to examine the expression of TLR9 in the pancreatic cancer, tissues near tumor, and normal pancreatic tissues which obtained during operation from 30 pancreatic carcinoma patients and 10 normal non-lump patient. The relationships with pathological grade, clinical stage, and metastasis of pancreatic cancer were statistically analyzed. Results The amplification value level of TLR9mRNA expression in human pancreatic tissues, paracancerous tissues were 2.32（1.41~3.22）and 1.23（1.18~1.28），respectively（t=2.642,p=0.023）.The высокая экспрессия TLR9 значительно коррелировала со степенью дифференцировки опухоли, а [Ключевые слова] новообразования поджелудочной железы; рак; Toll-подобный рецептор 9 Толл-подобные рецепторы (TLR) — это недавно открытое древнее семейство рецепторов, которые не только важны для естественного иммунитета, но и тесно связаны со специфическим иммунитетом, иммунной толерантностью, а также профилактикой и лечением некоторых заболеваний. Высокоэкспрессированный TLR9 постепенно снижался (c2=13,99, P=0,001), и было установлено, что высокоэкспрессированный рецептор TLR9 участвует в развитии различных злокачественных опухолей [1]. TLR9 является важным членом этого семейства и способен стимулировать экспрессию большого количества цитокинов и хемокинов, таких как интерлейкин (IL)-12, IL-6, интерферон-γ, ингибиторный белок моноцитов и металлоплазматические протеазы В-клетками и дендритными клетками[2]. Высокоэкспрессированный TLR9 был обнаружен во многих опухолях, но неясно, связан ли TLR9 с развитием рака поджелудочной железы. Целью данного исследования было изучить связь между экспрессией TLR9 в раке поджелудочной железы и развитием рака поджелудочной железы, а также исследовать его клиническое значение, чтобы создать новую основу для лечения рака поджелудочной железы. Данные и методы I. Клинико-патологические данные Тридцать свежих тканей рака поджелудочной железы человека и соответствующие параканкрозные ткани (1-2 см по краю опухоли) были получены от больных раком поджелудочной железы, а 10 образцов нормальной ткани поджелудочной железы были получены от неопухолевых пациентов, которым потребовалась частичная панкреатэктомия по другим причинам. Послеоперационная патология подтвердила, что предоперационная лучевая и химиотерапия не проводилась. Образцы собирали сразу после хирургической резекции, в двух экземплярах, один сразу в жидком азоте, а затем хранили при -80°C. Другая часть была зафиксирована в 10% формальдегиде и помещена в парафин для иммуногистохимического анализа. 19 из 40 пациентов были мужчинами и 11 женщинами, в возрасте 39-75 лет, средний возраст 57 лет. Гистопатологическая градация опухолей: 12 случаев высокодифференцированных и 18 случаев умеренно слабодифференцированных. 10 случаев метастазирования в лимфатические узлы и 20 случаев без метастазирования. II. Количественная ПЦР в реальном времени для экспрессии гена TLR9 Тотальную тканевую РНК выделяли согласно инструкции набора Trizol (sigma), чистоту и концентрацию РНК определяли с помощью УФ-спектрофотометра. кДНК затем синтезировали методом обратной транскрипции с помощью ReverTra Ace (Toyobo). праймеры были разработаны в соответствии с последовательностью мРНК TLR9 человека GenBank, с последовательностью праймера TLR9 вверх по течению: 5´-… GCCCAAATCCCTCCATATCCC-3´, вниз по течению: 5´-AACAGTTTGCCGTCCATGAATAG-3´, продукт амплификации 113bp. Праймеры для внутреннего эталона β-актина, вверх по течению: 5´-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3´, вниз по течению: 5´- TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3´, продукт амплификации 190 п.н. (Shanghai Biotechnology Service Co.) Для выявления TLR9мРНК использовалась количественная ПЦР в реальном времени (SYBR GREEN). Процедура реакции кривой амплификации: 50°C в течение 2 мин, 95°C в течение 2 мин, затем денатурация при 95°C в течение 15 с, отжиг в течение 15 с и удлинение при 72°C в течение 45 с в общей сложности 40 циклов. ΔCT=CT(целевой ген)-Ct(β-актин) для рака поджелудочной железы или соответствующих параканкрозных тканей и ΔCT=ΔCT эксперимент-ΔCT контроль для 10 нормальных тканей поджелудочной железы, и мы использовали среднее значение ΔCT для 10 нормальных тканей поджелудочной железы в качестве контроля. Плоидность амплификации = 2-ΔΔCT была получена путем расчета. III. Иммуноблоттинг для выявления экспрессии белка TLR9 Экстракция тканевого белка проводилась обычными методами, а концентрация белка измерялась методом Komas Brilliant Blue. 15 мкл белка брали для 10% полиакриламидного гель-электрофореза, переносили на нитроцеллюлозную мембрану, использовали 5% сухое обезжиренное молоко для запечатывания неспецифического антигена, добавляли кроличье античеловеческое моноклональное антитело TLR9 (компания cell signaling), разбавленное 1:750, инкубировали в течение ночи при 4°C, мембрану промывали TBST, содержащим 0,1% Tween 20, добавляли пероксидазу хрена (HRP). Козье антирабитовое вторичное антитело инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. После промывки мембраны добавляли субстрат усиленной хемилюминесценции EcL Plus и экспонировали на x-пленку в течение 30 с. Пленку регулярно проявляли и фиксировали. Изображения сканировали и анализировали с помощью программного обеспечения для автоматизированного анализа изображений гелей электрофореза (Band scan v5.0). IV. Иммуногистохимическое определение экспрессии белка TLR9 методом иммуногистохимии SP (стрептавидин-перозидаза), согласно инструкции к набору для иммуногистохимии (Wuhan PhD Co., Ltd.). В качестве положительного контроля использовались срезы известной TLR9-позитивной ткани рака легкого [3], а в качестве отрицательного контроля — PBS вместо первичного антитела. Под микроскопом клетки, окрашенные в коричнево-желтый цвет, считались положительными, а окрашивающий материал был зернистым или хлопьевидным, присутствующим в основном в цитоплазме опухолевых клеток. Результаты окрашивания оценивали двойным слепым методом, наблюдая в случайном порядке 10 полей с большим увеличением, избегая краев опухоли и некротических участков. Полуколичественный анализ проводили в соответствии с интенсивностью развития цвета и процентом окрашивания, а клетки классифицировали по степени положительного окрашивания: 0 — отрицательные, 1 — слабо положительные, 2 — умеренно положительные и 3 — сильно положительные. Процент положительного окрашивания делился на: 0 — отсутствие окрашивания, 1 — общее количество положительных клеток <25%, 2 - положительные клетки от 25% до 49% и 3 - общее количество положительных клеток выше 50%. Эти два показателя суммировались, при этом 0-1 был отрицательным (С), 2-3 - слабо положительным (), 4-5 - положительным () и 5 и более - сильно положительным (). () с () для высокой экспрессии и (С) с () для низкой экспрессии. V. Статистические методы Программа статистического анализа SPSS 13.0 использовалась для применения t-теста, χ2-теста, точного вероятностного метода Фишера и теста ранговых сумм для анализа различий и корреляций между значениями. при α=0. 05 в качестве тестового уровня и P<0.05 как статистически значимое различие. Результаты 1 Результаты количественной ПЦР в реальном времени TLR9 мРНК и β-актин мРНК были экспрессированы в нормальной ткани поджелудочной железы, ткани рака поджелудочной железы и параканкрозной ткани поджелудочной железы. В качестве контроля использовалась мРНК TLR9 в нормальных тканях поджелудочной железы. Кратность амплификации мРНК TLR9 при раке поджелудочной железы составила 2,32 (1,41~3,22), а при паранеопластических тканях - 1,23 (1,18~1,28), и разница в экспрессии между двумя группами была значительной (t=2,642, p=0,023). 2 Результаты иммуноблотинга Как видно на рисунке 1, экспрессия внутреннего эталонного белка GAPDH наблюдалась в раковых и парараковых тканях, а также в нормальных тканях поджелудочной железы, с полосами белка на уровне 36 кДа и TLR-9 на уровне 130 кДа. Экспрессия TLR9 в раковых тканях была значительно выше, чем в соответствующих парараковых и нормальных тканях поджелудочной железы. Рисунок 1 Результаты иммуноблотинга белка TLR-9 (1: нормальная поджелудочная железа, 2: параканкрозная ткань поджелудочной железы, 3 ткань рака поджелудочной железы) 3 Иммуногистохимические результаты Белок TLR9 в основном экспрессировался в цитоплазме раковых клеток, которая имела загорелый или коричневый цвет и окрашивалась равномерно; экспрессия белка TLR9 также наблюдалась в цитоплазме параканкрозных и нормальных тканей поджелудочной железы, но она была светло-желтой и менее частой, чем в тканях рака поджелудочной железы (рис. 2). 10/30) и 73,3% (22/30), со статистически значимыми различиями между группами (χ2=13,99, P=0,001) (табл. 1). В нормальных тканях поджелудочной железы не наблюдалось высокой экспрессии TLR9, в то время как 73,3% (22/30) тканей рака поджелудочной железы показали высокую экспрессию белка TLR9. Высокая экспрессия белка TLR9 в 30 тканях рака поджелудочной железы не была связана с расположением и размером опухоли (P>0,05), но была связана со степенью дифференцировки опухоли, стадией TNM и метастазированием в лимфатические узлы (P<0,05, Таблица 2). Рисунок 2 Экспрессия белка TLR9 в тканях рака поджелудочной железы, параканкрозных тканях поджелудочной железы и нормальных тканях поджелудочной железы (×200); ткани рака поджелудочной железы (A), параканкрозные ткани поджелудочной железы (B), нормальные ткани поджелудочной железы (C). Таблица 1 Экспрессия белка TLR9 в нормальных, паранеопластических и раковых тканях поджелудочной железы группа Пример TLR9 белок положительный Уровень позитивности (%) Позитив отрицательный нормальные ткани паранеопластические ткани ткани рака поджелудочной железы 10 30 30 2 20 22 8 10 8 20.0 33.3 73.3 Таблица 2 Связь между высокой экспрессией TLR9 в тканях рака поджелудочной железы и патологическими параметрами Клинические особенности Количество случаев Положительный при высокой экспрессии TLR9 Отрицательный при высокой экспрессии TLR9 Уровень позитивности (%) P-значение место опухоли головка поджелудочной железы хвост тела поджелудочной железы 20 10 15 7 5 3 75.0% 70.0% 1.00 Размер опухоли ≤3 см >3 см 17 13 13 9 4 4 76.5% 69,2% от 0.68 степень дифференциации высокодифференцированный гипофракционированный 12 18 6 16 6 2 50.0% 88.9% 0.034 Стадия TNM І CП Ш- 13 16 7 15 6 1 53.8% 93.8% 0.026 Метастазы в лимфатических узлах нет Был 20 10 13 9 7 1 65.0% 90.0% 0.024 Примечание: для статистического анализа применялся тест χ2, точный вероятностный метод Фишера Обсуждение TLRs — это недавно открытые рецепторы распознавания паттернов патогенов, которые распознают консервативные молекулярные компоненты определенных типов микроорганизмов, т.е. патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMPs). в 1997 году Меджитов [4] и др. впервые идентифицировали первый Toll человека. Среди них TLR9 является важным членом семейства TLR, чьими специфически распознаваемыми PAMPS являются CpG-мотивы в бактериальной и вирусной ДНК или синтетических олигодезоксинуклеотидах (CpG-). Олигодезоксинуклеотиды, CpG-ODN) [5], TLR9 имеет важное биологическое значение в опосредовании активации врожденного иммунитета экзогенной CpG ДНК. Помимо антиинфекционных эффектов, TLR9 также связан с аутоиммунными расстройствами и злокачественным опухолеобразованием [6]. Предполагается, что сигнальные пути, индуцируемые TLRs, включая TLR9, могут играть важную роль в образовании опухолей, и что повышение экспрессии TLRs может быть тесно связано с возникновением и развитием рака желудка, кишечника и легких [7].

Исследование также показало, что экспрессия TLR9 на опухолях может обеспечить новые подходы к химиотерапии и иммунотерапии опухолей.

Однако мало что известно об экспрессии и роли TLR9 при раке поджелудочной железы. В этом исследовании TLR9 был обнаружен в опухолевых тканях рака поджелудочной железы на генном и белковом уровне, а также размер белка TLR9, и сравнен с параканкрозными тканями поджелудочной железы и нормальными тканями поджелудочной железы. Результаты на генном уровне показали, что мРНК TLR9 была экспрессирована в тканях рака поджелудочной железы, параканкрозных тканях поджелудочной железы и нормальных тканях, но экспрессия была самой высокой в раковых тканях и значительно выше, чем в нераковых тканях (P<0,05). ). При иммуногистохимическом окрашивании изображений было обнаружено, что TLR9 преимущественно экспрессируется в цитоплазме клеток аденокарциномы поджелудочной железы, а уровень положительной экспрессии TLR9 был значительно выше в тканях аденокарциномы поджелудочной железы, чем в параканкрозных и нормальных тканях поджелудочной железы, что согласуется с результатами положительной корреляции в исследовании Droemann [3] при раке легких. Высокая экспрессия TLR9 в тканях рака поджелудочной железы не была связана с возрастом пациента, полом, расположением и размером опухоли, а также со степенью дифференцировки опухоли, стадией TMN, метастазами в лимфатические узлы или отдаленными метастазами, что позволяет предположить, что рецепторы TLR9 вовлечены не только в физиологические функции, такие как рост и развитие нормальной ткани поджелудочной железы, но и в процесс злокачественной трансформации ткани поджелудочной железы. исследования Шмауссера [8] и др. подтвердили значение TLR9, наряду с другими TLR, участвует в канцерогенезе желудка Результаты настоящего исследования согласуются с этим. В последние годы большое количество исследований подтвердило, что CpG ODN обладает сильным иммунным апоптотическим эффектом в направлении Th1, в основном за счет связывания с TLR9 и индуцирования секреции цитокинов полярности Th1, таких как IFN-7 и IL-12, способствующих дифференциации клеток Th0 в Th1. Например, CpG ДНК попадает в дендритные клетки посредством последовательного не зависимого рецептор-опосредованного эндоцитоза, специфически взаимодействует с TLR9 в лизосомальной области, а затем активирует нижележащие сигнальные пути через IRAK1, IRF7, TRAF6, MAPK, пути ядерного фактора-KB (NF-KB) и артикулятор MyD88 [9]. В данном исследовании изучался TLR9 в тканях рака поджелудочной железы на уровне генов и белков, а также размер белка TLR9. Эти зрелые антигенпрезентирующие клетки экспрессируют ко-стимулирующие молекулы (CD80, CD86), хемокиновый рецептор CCR7, секретируют цитокины Th1-типа и активируют NK-клетки [10], которые в дальнейшем вызывают созревание большего количества плазматических клеток и дендритных клеток и представление антигенов из-за повышенной экспрессии Fc-рецепторов на поверхности нейтрофилов и усиления цитотоксической активности. Благодаря действию CpG и TLR9 антигенпрезентирующие клетки, такие как Dc-клетки, могут перекрестно представлять экзогенные антигены, тем самым перекрестно активируя активацию CD8+ Т-клеток, NK-клеток, макрофагов, создавая иммунный ответ Th1-типа и активируя естественный иммунный ответ [11]. В настоящее время CpG ODN используется в качестве иммунного адъюванта для индуцирования сильного иммунного ответа Thl-типа через TLR-9 на клетках аденокарциномы легких человека A549, что может применяться в качестве монотерапии или адъювантной терапии к иммунотерапии при лечении опухолей [12]. Высокая экспрессия TLR9 в тканях рака поджелудочной железы предполагает, что он может быть новой мишенью для терапии опухолей. Экспрессия белка TLR9 коррелирует со злокачественностью клеток рака поджелудочной железы и наличием метастазов в лимфатических узлах, что дает основание для лечения и прогноза рака поджелудочной железы. Иммунотерапия рака поджелудочной железы с использованием связанного с TLR9 лиганда CpG ODN может предложить новые терапевтические возможности для лечения рака поджелудочной железы. Ref. 1. Jurk M, Vollmer J. Therapeutic Applications of Synthetic CpG Oligodeoxynucleotides as TLR9 Agonists for Immune Modulation [J]. BioDrugs,2007;21(6):387-401. 2. Theiner G, Rossner S, Dalpke A, et al. TLR9 взаимодействует с TLR4 для увеличения высвобождения IL-12 дендритными клетками мыши[J]. Molecular Immunology,2008;45(1):244-252. 3. Droemann D, Albrecht D, Gerdes J, et al. Клетки рака легких человека экспрессируют функционально активный Toll-подобный рецептор 9[J]. Respir Res, 2005, 6(1):1-10. 4. Меджитов Р., Престон-Херлбурт П., Джейнвей К. Человеческий гомолог белка Toll дрозофилы сигнализирует об активации адаптивного иммунитета[J].   Nature, 1997, 388: 394C397. 5. Hemmi H, Takeuchi O, Kawai T, et al. Толл-подобный рецептор распознает бактериальную ДНК[J]. Nature, 2000, 408(6813):740. 6. Ishii KJ, Akira S. Innate immune recognition of, and regulation by, DNA [J]. Trends Immunol, 2006 Nov;27:525-532. 7. Coussens LM , Werb Z. Воспаление и рак[J] . Nature , 2002; 420 (6917): 860-867. 8. Шмаубер Б, Андрулис М, Эндрих Med Microbio, 2005, 295(3):179-185. 9. Underhill DM. Toll - like receptors : networking for success [J]. Eur J Immunol , 2003 , 33 (7) :1767. 10. Баллас З. Модуляция активности NK-клеток олигодезоксинуклеотидами CpG[J]. Immunol Res,2007;39(1-3):15-21. Krieg AM. Терапевтический потенциал активации Toll-подобных рецепторов 9[J]. Nat rev drug disc, 2006, 5:471-484. 12. Криг А.М. Агонисты толл-подобных рецепторов 9 (TLR9) в лечении рака[J]. Онкоген, 2008; 27:161-167. Эта статья была опубликована в журнале Chinese Journal of Pancreatic Diseases, том 3, 2011. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант № 30200272). Биография автора: Ву HQ, M, PhD, в основном при опухолях поджелудочной железы. E-mail:[email protected] За корреспонденцией следует обращаться к Ву Хэшуй, профессору, научному руководителю, Центр хирургии поджелудочной железы, Больница Юнион, Медицинский колледж Тунцзи, Хуачжунский университет науки и технологии, Ухань 430022, Китай; Email:[email protected].