|The
12-й Международный симпозиум по миелодиспластическим синдромам (МДС) прошел в Берлине, Германия, 8-11 мая 2013 года. Симпозиум проводится раз в два года и посвящен результатам исследований, связанных с миелодиспластическими синдромами (МДС). Симпозиум собрал экспертов в области МДС со всего мира для обсуждения актуальных вопросов в этой области. В то же время были представлены многие последние научные достижения в области MDS, охватывающие биологию, диагностику, прогноз и лечение MDS. Лю Синьцзянь, отделение гематологии, онкологическая больница Хэнань
Молекулярные механизмы патогенеза МДС, прогноз и достижения эпигенетической терапии
Мутации генов МДС
МДС — это группа клональных заболеваний стволовых гемопоэтических клеток, характеризующихся гемоцитопенией, аномальным развитием одной или нескольких линий миелоидных клеток (дисплазия), неполноценным гемопоэзом и повышенным риском развития острого миелоидного лейкоза (ОМЛ).Основными патофизиологическими сущностями МДС являются.
(i) клональное нарушение происхождения гемопоэтических стволовых клеток.
(ii) аномальное развитие одной или нескольких линий гранулоцитов, эритроцитов и мегакариоцитов.
(iii) Неэффективный гемопоэз. Клинические проявления MDS — это, в основном, снижение показателей периферической крови одной или нескольких линий и возникающие при этом признаки и симптомы, при этом заболевание заканчивается поражением костного мозга или развитием AML.
С помощью технологии микрочипов однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) и секвенирования всего генома или экзома было выявлено около 25-30 мутаций, участвующих в развитии МДС. В дополнение к ранее выявленным мутациям в онкогенах, онкогенах и генах, кодирующих транскрипционные факторы, были недавно выявлены два основных класса мутаций, затрагивающих гены, кодирующие эпигенетические регуляторы, и гены, кодирующие белки комплекса Шеддера, соответственно. Эти мутации могут сосуществовать в различных комбинациях у разных пациентов. Существует четкое совпадение между генами, кодирующими эпигенетические регуляторы в МДС и АМЛ, в то время как мутации в генах, кодирующих белки комплекса сдвига РНК, чаще встречаются в МДС.
Мутации в гене TET2 широко распространены в гематологических злокачественных опухолях, таких как MDS (25%), AML (10%), миелопролиферативные новообразования (MPN, 10%-30%) и хронический гранулоцитарный лейкоз (CMML, 50%). Белок, кодируемый геном TET2, индуцирует деметилирование, процесс, который также требует участия ионов железа (Fe2+) и α-кетоглутарата (α-KG), продукта окислительного декарбоксилирования изоцитрата, катализируемого изоцитратдегидрогеназой (IDH), и наличие мутаций в генах IDH1 или 2 может подавлять функцию белка TET2; поэтому мутации в гене TET2 и мутации в генах IDH1 или 2 часто Поэтому мутации в гене TET2 и генах IDH1 или 2 часто являются взаимоисключающими. Исследования подтвердили, что мутации TET2 могут быть связаны с эффективной лекарственной терапией деметилирования. Кроме того, большое когортное исследование показало, что мутации гена EZH2 связаны с плохим прогнозом у пациентов с МДС. Из найденных генов, кодирующих белки сдвигового комплекса SF3B1, SRSF2, U2AF1 и ZRSR2, только мутации в SF3B1 были сильно связаны с циклической железо-гранулоцитозной анемией, основным геном-возбудителем этого подтипа, и пациенты с мутациями в этом гене имели лучший прогноз.
Пересмотренная Международная прогностическая скоринговая система (IPSS-R)
Международная прогностическая балльная система (IPSS) для MDS была предложена в 1997 году, а прогностическая балльная система ВОЗ (WPSS) была предложена в 2005 году на основе критериев стадирования Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (2001). В последние годы цитогенетические прогностические группировки в этих двух системах были пересмотрены следующим образом
(i) очень хорошо: делеция длинного плеча хромосомы 11 [del(11q)], -Y.
(ii) Хорошие: нормальные, der(1;7), del(5q), del[12 short arm (p)], del(20q), 2 аномалии с del(5q).
(iii) умеренная: 7q-, +8, i(17q), +19, любая другая индивидуальная аномалия или 2 отдельных клона.
(iv) Бедные: -7, inv(3)/t(3q)/del(3q), 2 аномалии, содержащие -7/7q-, 3 аномалии.
⑤ очень плохо: 3 и более аномалий.
В 2011 году WPSS был пересмотрен, чтобы изменить зависимость от трансфузии эритроцитов на зависимость от наличия тяжелой анемии (<90 г/л у мужчин и <80 г/л у женщин). В 2012 году был введен IPSS-R: примитивные клетки были классифицированы на ≤2%, >2% — <5%, 5% - 10% и >10% — 30%; прогностическая группировка кариотипа использовала вышеупомянутый 5-компонентный подход; уточнен гематокрит. В соответствии с прогностическим риском IPSS-R были разделены на пять групп: очень низкий риск, низкий риск, промежуточный риск, высокий риск и очень высокий риск, с медианой выживаемости 6,8, 4,3, 2,3, 1,5 и 0,9 лет, соответственно, и медианой времени до трансформации AML Не достигнуто, не достигнуто, 15,7, 4,8 и 2,6 лет соответственно.
▪ Эпигенетические методы лечения
Основные методы лечения включают метилирование ДНК, которое может подавлять экспрессию генов через модификации метилирования, и деацетилирование гистонов, которое влияет на транскрипционную активность ДНК путем изменения структуры хроматина, и деацетилирование гистонов, которое приводит к «заглушению» генов, связанных с дифференцировкой клеток и торможением опухолевого роста из-за эпигенетических изменений в ДНК и/или гистонах. «Эти эпигенетические изменения обратимы, то есть их можно обратить вспять с помощью ингибиторов ДНК-метилтрансферазы (например, децитабина) и ингибиторов деацетилазы, и эпигенетические методы лечения изучаются с большим интересом.
Эпигенетические аномалии являются одним из основных молекулярных механизмов, лежащих в основе развития и эволюции МДС. В 2010 году было показано, что метилирование ДНК предсказывает выживаемость и ответ на лечение у пациентов с МДС, а исследование, в котором определяли пациентов с МДС с помощью фенотипа метилирования островов CpG (CIMP), показало, что наличие CIMP значительно связано с плохим прогнозом и риском лейкемической трансформации у пациентов с МДС. Исходные уровни метилирования не были значимо связаны с ответом на лечение децитабином, а продолжительность снижения метилирования была связана с лучшими клиническими исходами. Кроме того, исследования показали, что децитабин значительно продлевает выживаемость без прогрессирования (PFS) у пациентов с МДС промежуточного и высокого риска. Недавнее клиническое исследование II фазы, опубликованное в журнале Journal of Clinical Oncology, оценивало эффективность подкожного применения децитабина в низких дозах у пациентов с МДС низкого и промежуточного риска-1. В исследование были включены 65 пациентов, разделенных на 2 группы и получавших лечение по схеме А (децитабин 20 мг/м2 подкожно в дни 1, 2 и 3, 1 курс каждые 28 дней) и схеме В (децитабин 20 мг/м2 подкожно в дни 1, 8, 15 и 22, 1 курс каждые 28 дней). Медиана последующего наблюдения составила 14,6 месяцев. Результаты показали, что 67% пациентов в схеме А и 59% в схеме В не зависели от переливания эритроцитов и тромбоцитов, и около 70% пациентов выжили до 500 дней.
Достижения в области эпигенетического лечения ХММЛ
▪ Текущий статус лечения ХММЛ
Хронический гранулематозный моноцитарный лейкоз (ХГМЛ) сочетает в себе черты как миелопролиферативных новообразований (МПН), так и миелодиспластических синдромов (МДС), поэтому ХГМЛ также определяется как синдром перекрытия МПН/МДС. Пациенты отличаются разнообразием клинических проявлений, выживаемостью и рутинными анализами крови. В целом, средняя продолжительность жизни пациентов составляет около 20 месяцев, и это может быть связано с долей примитивных клеток костного мозга. 15%-30% пациентов с ХММЛ могут прогрессировать в АМЛ. В настоящее время лечение ХММЛ ограничивается антипролиферативными препаратами, которые направлены только на MPN-подтип ХММЛ. Кроме того, хотя клональные цитогенетические аномалии встречаются в 20%-30% случаев ХММЛ, эти аномалии не являются специфичными для ХММЛ, и большинство пациентов имеют нормальный кариотип. Последние биологические исследования также не оказали эффективного влияния на варианты лечения, и нет лучших способов достижения эффективной ремиссии у пациентов.
Достижения в области эпигенетической терапии
Недавнее исследование, представленное на 12-м Международном симпозиуме по МДС, показало, что децитабин эффективен в лечении пациентов с ХММЛ, при этом показатели полной ремиссии (ПР) + полной миелоидной ремиссии (ПМР) достигают 40,5%. В то же время, показатели ремиссии у пациентов могут быть еще более улучшены путем увеличения продолжительности лечения децитабином за счет устойчивого деметилирования. В исследование были включены 44 пациента с ХММЛ, получавшие децитабин [20 мг/(м2・д) в течение 5 дней, каждые 28 дней] в течение не менее 6 циклов лечения. После 4 и 6 циклов лечения пациентов оценивали на предмет ремиссии в соответствии с критериями Международной рабочей группы (IWG) 2006 года. Результаты показали, что из 43 пациентов, оцененных в соответствии с классификацией Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), 27 были больны ХММЛ типа I и 16 — ХММЛ типа II. Средний возраст пациентов составил 71 год, средняя продолжительность лечения — 8 циклов. Из них 11 пациентов прошли <4 циклов, 17 пациентов - 4-6 циклов и 15 пациентов - >6 циклов. 81% пациентов с ХММЛ-I прошли >4 циклов. После 4 циклов лечения 14% больных ХММЛ получили CR; 18,6% больных ХММЛ получили mCR; 2,3% больных ХММЛ находились в частичной ремиссии (PR); и 34,9% больных ХММЛ имели стабильную болезнь (SD). После 2 циклов лечения децитабином частота CR увеличилась до 16,2%, частота mCR увеличилась до 24,3%, частота SD уменьшилась до 18,9%, а частота CR+mCR достигла 40,5%. Основными причинами прекращения терапии децитабином были прогрессирование заболевания (35%), смерть (23%) и токсические реакции на препарат (7%). В настоящее время 7 (16,3%) пациентов продолжают лечение. Продолжительность ремиссии у пациентов, достигших ремиссии после 6 циклов лечения, составила 9,7 месяцев. У 7 из 43 пациентов, подлежащих оценке, наблюдалась одна серьезная инфекция, по одной сердечной и желудочно-кишечной токсической реакции 3/4 класса. В этом небольшом когортном исследовании пациентов с ХММЛ исследователи не получили клинических характеристик или цитогенетических изменений, которые могли бы предсказать ремиссию заболевания у пациентов.
Решение о лечении пациентов с ХММЛ децитабином может быть принято в статье Aribi et al. в 2007 году в журнале Cancer. В статье предлагается рассмотреть возможность применения децитабина в следующих ситуациях.
(i) Наличие клинических проявлений ХММЛ, таких как лихорадка, потеря веса, спленомегалия, лейкоцитоз и другие признаки и симптомы тяжелой степени.
(ii) Прогрессирующее снижение количества клеток крови, например, анемия, тромбоцитопения, зависимость от переливания крови.
(iii) ХММЛ с поражением органов, например, поражение кожи, почечная недостаточность, легочные симптомы.
(iv) Увеличение количества примитивных клеток, при этом примитивные клетки костного мозга увеличиваются до 5% или 10% и более.
▪ Исследования, связанные с мутациями гена CMML
Молекулярно-генетические аномалии присутствуют у 80% пациентов с ХММЛ, при этом наиболее распространенными мутациями являются TET2 (58%), SRSF2 (46%) и ASXL1 (40%). Недавние исследования показали, что мутации в генах, связанных со сдвигом РНК, играют важную роль в развитии миелоидных злокачественных опухолей. Мутации в гене SF3B1 наиболее часто (75%-80%) встречаются у пациентов с МДС с кольцевидными железистыми гранулоцитами (RS). Напротив, мутации в гене сдвига SRSF2 в основном связаны с ХММЛ. Другое китайское исследование, представленное на 12-м Международном симпозиуме по МДС и посвященное оценке частоты мутаций SRSF2, также подтвердило, что мутации SRSF2 были преобладающей мутацией сдвига у пациентов с ХММЛ и были связаны с пожилым возрастом и худшим прогнозом. В исследование были включены 20 пациентов с ХММЛ, для выявления мутаций использовалась полимеразная цепная реакция (ПЦР) в сочетании с прямым секвенированием. Результаты показали, что 11 мужчин и 9 женщин, средний возраст которых составил 62 года, имели мутации SRSF2 у 4 пациентов (20%), но не мутации SF3B1. Кроме того, исследователи предполагают, что децитабин может облегчить анемию и тромбоцитопению у пациентов с мутациями SRSF2, но для этого необходима более крупная выборка.
На 12-м Международном симпозиуме по МДС было представлено еще несколько исследований, связанных с ХММЛ. В одном из этих исследований оценивалась роль массивов однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в диагностике и прогнозировании прогноза у пациентов с ХММЛ низкого риска. Это исследование показало, что SNP-массивы могут выявлять хромосомные аномалии, которые не обнаруживаются традиционными цитогенетическими методами. Применение этого метода к серии пациентов может помочь лучше понять особенности заболевания ХММЛ. Кроме того, другое исследование показало, что регуляторные Т-клетки (Tregs) могут быть значительно повышены у больных ХММЛ с мутациями в гене TET2, значение которых нуждается в дальнейшем изучении. По мере проведения дополнительных исследований в области ХММЛ, текущее состояние лечения ХММЛ будет постепенно улучшаться.
Создание мышиной модели МДС и эффективность деметилирующих препаратов
Молекулярно-генетические изменения МДС и создание мышиных животных моделей
На основании морфологических изменений и доли примитивных клеток пересмотренные в 2008 году критерии классификации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) подразделяют СДС на: рефрактерную гемоцитопению с однолинейными аномалиями развития (RCUD), рефрактерную анемию с кольцевидными железистыми гранулоцитами (RARS), рефрактерную гемоцитопению с многолинейными аномалиями развития (RCMD), рефрактерную гемоцитопению с пролиферацией примитивных клеток-1 ( RAEB-1, примитивные клетки 5%-9%), рефрактерная гемоцитопения с примитивными клетками-2 (RAEB-2, примитивные клетки 10%-19%), МДС с простой 5q- и МДС неклассифицируемая (MDS-U).
Последние исследования показали, что приобретение множественных наследственных соматических мутаций и/или эпигенетических аномалий (метилирование ДНК, ацетилирование гистонов) в нормальных гемопоэтических стволовых или прогениторных клетках приводит к аномальному самообновлению клеток, а также к дифференцировке и созреванию, в результате чего образуются злокачественные клоны гемопоэтических стволовых клеток, которые лежат в основе патогенеза МДС и АМЛ. Известные в настоящее время молекулярные события сосредоточены на транскрипционных факторах, путях передачи сигнала, эпигенетических модификациях и микроокружении стволовых клеток, включая TET2, NRAS, KRAS, CBL, ETV6, EZH2, ASXL1, TP53, RUNX1, FLT3, MLL-PTD, WT1, SF3B1 и SRSF2.
Мутации в транскрипционном регуляторе RUNX1 более распространены у пациентов с АМЛ и МДС (13,1% и 17,5%, соответственно), а ген RUNX1 кодирует белок RUNX1, который объединяется с CBFβ и образует транскрипционный комплекс core binding factor, регулирующий экспрессию нескольких генов, связанных с кроветворением. В настоящее время существует 2 основные категории мутаций RUNX1.
(i) происходящие в N-конце RUNX1 (распространенная мутация RUNX1D171N), в основном в структурном домене RHD, влияющие на связывание RUNX1 с ДНК.
Аномалии генов MLL являются еще одним распространенным генетическим изменением при МДС и МДС/АМЛ. Белки MLL полагаются на активность метилтрансфераз для опосредования модификаций хроматина и, таким образом, регулируют экспрессию связанных с ними генов. Помимо хромосомных эктопий с участием MLL, другой тип аномалий MLL проявляется в основном в виде частичных тандемных повторов MLL (MLL-PTD). 7,5% пациентов с АМЛ имеют MLL-PTD, а 4,2% — МДС. Исследования показали, что мутации MLL-PTD и RUNX1 часто присутствуют на момент прогрессирования заболевания у пациентов с МДС, при этом доля сосуществующих мутаций выше как в первичном, так и во вторичном АМЛ. Это приводит к гипотезе, что мутации RUNX1 и MLL-PTD действуют синергично, вызывая развитие МДС и трансформацию АМЛ.
Для дальнейшего подтверждения вышеизложенной гипотезы были сконструированы три животные модели МДС/АМЛ на основе мышей MLL-PTD knock-in (knock-in) с различными мутациями в RUNX1 следующим образом.
(i) MLL-PTD/RUNX1-/- модель.
(ii) Модель MLL-PTD/RUNX1- D171N BMT.
③MLL-PTD/RUNX1- 291fs Модель BMT. Сначала был применен Mx1-Cre и нокаутирован аллель RUNX1 у мышей MLL-PTD knock-in. Через 1 месяц после индукции pIpC у мышей PTD/RUNX1-/- наблюдалась значительная гипоплазия тромбоцитов, а через 2-4 месяца — макроцитарная анемия и лейкопения. Морфологический анализ костного мозга и периферической крови выявил характерные изменения аномального развития линий гранулозы, эритроцитов и мегакариоцитов. Большинство мышей PTD/RUNX1-/- погибло в течение 8 месяцев, медиана выживаемости составила 149 дней. Затем были созданы модели трансплантированных мышей путем конструирования ретровирусных плазмид RUNX1D171N и RUNX1s291fs и заражения ими клеток костного мозга мышей дикого типа (WT) и MLL-PTD-нокаутов. В дополнение к макроцитарной анемии, тромбоцитопении и морфологическим аномалиям, в костном мозге пересаженных мышей часто наблюдалось увеличение примитивных клеток (особенно у пересаженных мышей MLL-PTD/RUNX1-291fs), а серийные трансплантации костного мозга показали, что фенотип заболевания MLL-PTD/RUNX1-291fs MDS был трансплантируемым, но не подвергался трансформации AML.
Эффективность деметилирующих препаратов
Предыдущие исследования показали, что несколько генов гиперметилированы у пациентов с МДС, в результате чего Управление по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) одобрило ингибиторы трансферазы метилирования 5-азацитидин и 5-азидо-2′-дезоксицитидин (децитабин) для лечения МДС. Последний обращает вспять аберрантное гиперметилирование цитозинов в CpG-островах ДНК и реактивирует гены-супрессоры опухолей, которые были генетически «заглушены» из-за гиперметилирования, оказывая тем самым опухолеподавляющее действие. Клинические испытания показали, что децитабин эффективен при МДС промежуточного и высокого риска и МДС/АМЛ, при этом показатели эффективности варьируются от 30% до 73%. Используя дот-блот анализ, исследователи изучили экспрессию 5-mc и 5-hmc в MLL-PTD/RUNX1-291fs трансплантированных мышиных lin-Kit+ гемопоэтических стволовых клетках, и показали, что по сравнению с контрольной группой, экспрессия 5-mc в MLL-PTD/RUNX1-291fs трансплантированных мышиных lin-Kit+ гемопоэтических стволовых клетках был значительно увеличен, что говорит о повышении уровня метилирования их ДНК. Выживаемость крыс с трансплантацией MLL-PTD/RUNX1-291fs, получавших децитабин в низкой дозе (0,3 мг/кг, подкожно дважды в неделю), была значительно выше, чем у контрольных крыс с физраствором [(94,5±6,4) дней против (53,5±3,5) дней, P<0,001]. Пересаженные клетки мышиного костного мозга MLL-PTD/RUNX1-291fs культивировали в серии колоний in vitro и обрабатывали децитабином (0,5 мкМ), что показало значительное снижение числа колоний в группе, обработанной децитабином (34±7,7 против 619±30,5, P<0,001), и способствовало дифференцировке клеток; однако для исходных клеток MDS (MICs) эффект одного лишь децитабина был ограничен. Однако на исходные клетки MDS (MICs) один только децитабин оказывал ограниченное действие и не смог значительно снизить количество MICs и способность к колониеобразованию, что может быть одним из возможных механизмов клинической резистентности к децитабину. В заключение следует отметить, что создание мышиной модели МДС не только вносит вклад в изучение патогенеза МДС, но и является полезным инструментом для реализации новых терапевтических стратегий в отношении МДС. Кроме того, хотя лечение децитабином в низких дозах может продлить выживание мышей, трансплантированных MLL-PTD/RUNX1-291fs, способствуя дифференцировке клеток, децитабин сам по себе имеет ограниченную эффективность в отношении MICs, и дальнейшее сочетание с другими препаратами, направленными против MICs, может повысить эффективность. Источник: China Medical Tribune