VEGFR-3, также известный как Flt-4, который действует как тирозинкиназный рецептор для VEGF-C/D, экспрессируется в кровеносных синусоидах печени и селезенки, при восстановлении травм и в зарождающемся сосудистом эндотелии опухолевых тканей, в дополнение к тому, что он в основном экспрессируется в эндотелиальных клетках лимфатических сосудов. Сяопин Ма, отделение акушерства и гинекологии, Цзянсуский провинциальный госпиталь интегративной медицины Последние данные свидетельствуют о том, что экспрессия VEGFR-3 присутствует и в самих опухолевых клетках и участвует в прогрессировании злокачественной опухоли несколькими путями. В данном исследовании экспрессия VEGF-C, VEGF-D и VEGFR-3/Flt-4 в тканях раннего рака шейки матки была определена иммуногистохимическим методом SP, также была определена VEGFR-3/Flt-4-меченая сосудистая плотность (MVD) для анализа ее связи с клиникопатологическими факторами и изучения роли VEGFR-3/Flt-4 в процессе прогрессии раннего рака шейки матки. Была изучена роль VEGFR-3/Flt-4 в прогрессировании раннего рака шейки матки. 1. Материалы и методы 1.1 Объекты исследования 41 случай хирургической резекции тканей рака шейки матки были отобраны, зафиксированы 4% параформальдегидом и помещены в парафин. Лучевая терапия до операции не проводилась, патология была подтверждена после операции. Клиническая стадия соответствовала стандарту Международной федерации гинекологии и акушерства (FIGO, 2000), включая 7 случаев стадии Ia, 14 случаев стадии Ib и 20 случаев стадии IIa; гистологическая градация: G17 случаев, G2 13 случаев, G3 21 случай; гистологический тип плоскоклеточная карцинома 37 случаев, аденокарцинома 4 случая; 15 случаев с метастазами в лимфатические узлы, 26 случаев без метастазов в лимфатические узлы; возраст пациентов 26-70 лет, средний возраст 42 года Средний возраст составил 42 года, 12 случаев были постменопаузальными и 29 случаев пременопаузальными. При микроскопии раковые клетки были обнаружены в просвете лимфатических сосудов, 35 случаев без лимфатической инфильтрации и 6 случаев с лимфатической инфильтрацией. 1.2 Методы исследования 1.2.1 Иммуногистохимическое окрашивание методом SP Использовали иммуногистохимический набор SP и работали строго в соответствии с инструкцией. Восковой блок ткани подвергался серийному секционированию 5 мкм; ксилол подвергался обычной депарафинизации и гидратации; микроволновое термическое восстановление антигена (95°C, 10 мин), раствор для восстановления антигена — цитратный буфер (pH 6,0); 3% раствор перекиси водорода-метанола использовался в течение 10 мин для блокирования эндогенной пероксидазы; 10% козья сыворотка использовалась для блокирования неспецифических антител; первичное антитело: кроличье античеловеческое поликлональное антитело VEGF-C (1:50. ZA-0266); кроличье античеловеческое поликлональное антитело VEGF-D (1:100, BA1461); кроличье античеловеческое поликлональное антитело VEGFR-3 (1: 200, ab27278), инкубировать в течение 60 мин; добавить анти-кроличье биотинилированное вторичное антитело по капле, инкубировать в течение 30 мин; добавить меченную перекисью хрена аффинную цепь по капле, инкубировать в течение 30 мин; микроскопическая проявка DAB, гематоксилиновый PBS буфер использовался в качестве отрицательного контроля вместо первичного антитела, а известные участки рака молочной железы использовались в качестве положительного контроля. 1.2.2 Определение результатов Положительное окрашивание VEGF-C, VEGF-D, VEGFR-3/Flt-4 определялось как цитоплазма с коричневато-желтыми гранулами. В соответствии с методом, описанным Jüttner et al, положительные клетки классифицировались в зависимости от процента положительных клеток: — (нет положительных клеток), + (0-5% положительных клеток), +++ (5%-50% положительных клеток) и ++++ (>50% положительных клеток). MVD определяли по методу, описанному Weidner et al. Плотную область положительных люменов, т.е. область «горячей точки», искали под малым увеличением, наблюдали и подсчитывали под большим увеличением, а MVD выражали как среднее количество положительных люменов в пяти полях большого увеличения. 1.3 Статистическая обработка Все данные обрабатывались с помощью статистического программного обеспечения SPSS13.0. Данные измерения MVD выражались как ± s. Статистически значимым различием считалось P<0,05. 2. Результаты 2.1 Экспрессия VEGFR-3 в тканях рака шейки матки ранней стадии VEGFR-3/Flt-4 экспрессировался на эндотелиальных клетках лимфатических сосудов, в дополнение к некоторым сосудистым эндотелиальным клеткам. Морфологически VEGFR-3/Flt-4 положительная сосудистая сеть была частично сосудистой и частично лимфатической. Экспрессия белка VEGFR-3/Flt-4 также наблюдалась в некоторых воспалительных клетках, окружающих положительную сосудистую сеть (Рисунок 1A). Раковые клетки были видны в некоторых VEGFR-3/Flt-4 положительных сосудистых образованиях (Рисунок 1С). Экспрессия белков VEGF-C, VEGF-D и VEGFR-3/Flt-4 наблюдалась в опухолевых клетках, а уровень позитивности экспрессии составил 48,7% (20/41), 58,5% (24/41) и 63,4% (26/41), соответственно (Рисунок 1D, E, F). Рисунок 1 Экспрессия VEGFR-3/Flt-4 в тканях рака шейки матки ранней стадии 2. 2 Взаимосвязь между VEGFR-3/Flt-4 белком, MVD и клинико-патологическими факторами и экспрессией соответствующих белков в тканях рака шейки матки ранней стадии Экспрессия VEGFR-3/Flt-4 белка не была связана с менструальным статусом, гистологическим классом, гистологическим типом больных раком шейки матки, клинической стадией, метастазами в лимфатические узлы MVD не была связана с менструальным статусом, гистологическим классом, гистологическим типом, метастазами в лимфатические узлы и инфильтрацией лимфатических сосудов, но была связана с клинической стадией и белками VEGF-C и D. Таблица 1 Взаимосвязь между VEGFR-3/Flt-4 и MVD и клиникопатологическими факторами и экспрессией белков VEGF-C и D в тканях раннего рака шейки матки 3. Обсуждение Благодаря проангиогенным или пролимфангиогенным свойствам, семейство сосудистых эндотелиальных факторов роста VEGF-A, B, C, D, E и его рецепторы VEGFR-1, -2, -3 способствуют росту и метастазированию злокачественных опухолей Механизм действия VEGF-A, B, C, D, E и их рецепторов VEGFR-1, -2, -3 в стимулировании роста и метастазирования злокачественных опухолей и соответствующие стратегии генной терапии являются актуальной темой исследований. Современные исследования показывают, что опухолевый ангиогенез в основном регулируется VEGF-A/VEGFR-2, а опухолевый лимфангиогенез - VEGF-C, D/VEGFR-3. Результаты данного исследования показали, что VEGFR-3/Flt-4 экспрессируется на некоторых сосудистых эндотелиальных клетках в дополнение к эндотелиальным клеткам лимфатических сосудов. Морфологически VEGFR-3/Flt-4 положительная сосудистая сеть была частично сосудистой и частично лимфатической, а VEGFR-3/Flt-4-меченная положительная сосудистая плотность MVD коррелировала с клинической стадией и связанными с ней белками VEGF-C и D, но не с другими клиникопатологическими факторами, такими как менструальный статус и гистологический класс. Это отличается от результатов Yasuoka et al. Механизм может заключаться в том, что VEGFR-3/Flt-4 играет важную регуляторную роль как в опухолевом лимфангиогенезе, так и в ангиогенезе. Опухолевые клетки выделяют VEGF-C и D, которые действуют как паракринные рецепторы VEGFR-3/Flt-4 на эндотелиальных клетках лимфатических сосудов или эндотелиальных клетках сосудов, опосредуя пролиферацию, дифференцировку и формирование просвета эндотелиальных клеток. С одной стороны, увеличенные кровеносные сосуды в опухолевых тканях обеспечивают опухолевые клетки питательными веществами, необходимыми для роста, а с другой стороны, увеличенные лимфатические сосуды в опухолевых тканях обеспечивают каналы для инфильтрации опухолевых клеток и метастазирования, что способствует метастатическому распространению опухолевых клеток. Однако из-за отсутствия реальных эндотелиальных маркеров лимфатических сосудов, маркеры эндотелиальных клеток лимфатических сосудов в разных типах, разных участках и даже на разных стадиях развития в тканях отличаются, поэтому точный механизм роли VEGFR-3/Flt-4 в опухолевом ангиогенезе и образовании лимфатических сосудов требует глубокого изучения. Помимо того, что VEGFR-3/Flt-4 является рецептором для VEGF-C/D, который в основном экспрессируется в эндотелиальных клетках, последние данные показывают, что многие опухолевые клетки сами также экспрессируют Flt-4 и играют важную роль в процессе прогрессии опухоли. Клинические исследования многих злокачественных опухолей человека показали, что экспрессия VEGFR-3/Flt-4 в опухолевых клетках коррелирует с клинической стадией заболевания, дифференцировкой клеток, метастазированием в лимфатические узлы и прогнозом пациента. Ван и др. обнаружили, что VEGFR-3/Flt-4 дифференциально экспрессируется во время прогрессии от цервикальной интраэпителиальной неоплазии до инвазивной карциномы шейки матки, и поэтому предположили, что он может быть вовлечен в пролимфангиогенез при раке шейки матки. Поэтому выдвинута гипотеза, что он может быть вовлечен в трансформацию про-лимфангиогенного фенотипа во время трансформации рака шейки матки. Результаты исследований миграции и инвазии in vitro показали, что некоторые опухолевые клетки с сильной инвазивной способностью, такие как клеточная линия рака шейки матки SiHa, клеточная линия рака молочной железы MDA-MB-231 и Hs578T, имеют экспрессию Flt-4 в дополнение к VEGF-C. Человеческий рекомбинантный белок VEGF-C (Cys156Ser) может способствовать миграции и инвазивной способности опухолевых клеток. Напротив, применение рекомбинантного Flt-4/Fc для блокирования VEGFR-3/Flt-4, рецептора для VEGF-C, привело к значительному снижению миграции и инвазивной способности клеток. masood et al. предположили, что VEGFR-3/Flt-4 играет роль в стимулировании роста злокачественной мезотелиомы. dias et al. показали, что VEGFR-3/Flt-4 также может быть вовлечен в пролиферацию, выживание и формирование химиорезистентности клеток лейкемии. Результаты настоящего исследования показывают, что в тканях рака шейки матки экспрессия VEGFR-3/Flt-4 опухолевых клеток коррелирует с метастазированием в лимфатические узлы, лимфоваскулярной инфильтрацией и клинической стадией пациентов, а также с экспрессией их лигандов - белков VEGF-C и D. Механизм может заключаться в том, что опухолевые клетки выделяют VEGF-C и D, которые действуют на VEGFR-3/Flt-4 на самих опухолевых клетках в аутокринной форме, способствуя миграции и инфильтрации опухолевых клеток, что приводит к лимфоваскулярной инфильтрации опухоли и метастазированию в лимфатические узлы и участвует в прогрессии опухоли. Однако результаты исследования противоречивы, поскольку рецепторы VEGF-C/D гетерогенны в различных опухолевых клетках, и помимо VEGFR-3/Flt-4, рецепторы VEGF-C/D включают VEGFR-2, NRP-1 и NRP-2 и т.д. Результаты исследования Jüttner et al. позволили сделать вывод, что экспрессия VEGFR-3/Flt-4 в клетках рака желудка не связана с метастазированием в лимфатические узлы у пациентов. Кроме того, результаты этого исследования также показали, что экспрессия белка VEGFR-3/Flt-4 также наблюдалась в некоторых воспалительных клетках в интерстиции, окружающем опухолевую ткань, но его роль не ясна. Некоторые исследования показали, что воспалительные клетки в интерстиции опухолевой ткани также могут играть важную роль в процессе лимфангиогенеза опухоли. Таким образом, можно предположить, что роль VEGFR-3/Flt-4 в прогрессировании злокачественных опухолей шейки матки может быть многогранной, и его роль может быть различной для разных типов опухолей, а его точный механизм еще требует дальнейшего изучения.